Иммуноцитохимия: световая микроскопия

Эндрю Р. Хериет, Кевин С. Гаттер


1. Введение

Идея локализации антигенов в тканях с помощью антител впервые была реализована в начале 40-х гг. Впоследствии иммуноцитохимические методы стали широко применяться в молекулярной клинической диагностике, а с середины 70-х гг., после открытия моноклональных антител, их роль еще более возросла.

Иммуноцитохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые компоненты (антигены), основываясь на их связывании с антителами. Место связывания определяют при помощи меченых антител или методом вторичного мечения. Использование такого подхода для выявления патологии на клеточном уровне позволяет детально исследовать функции и химический состав клеток и сопоставлять полученные результаты с известными морфологическими данными, что дает возможность глубже проникнуть в суть патологического процесса.


Использование антител лежит в основе исследований самых разных молекулярных образований: структурных компонентов клетки, клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов), рецепторов на клеточной поверхности и т. д. Большинство антител связываются с компонентами и продуктами нормальных клеток, но некоторые специфичны в отношении антигенов, характерных для раковых клеток. Такие антитела использовались в качестве маркеров при исследовании процессов дифференцировки и трансформации клеток злокачественных новообразований. Однако наивно полагать, что с помощью антител можно прямо идентифицировать раковые клетки, скорее антитела лишь указывают на изменения картины генной экспрессии.


2. Выбор иммуноцитохимического метода

Из всего многообразия иммуноцитохимических методов (ИЦХ), играющих важную роль в молекулярной клинической диагностике, нужно выбрать один, наиболее приемлемый для данной лаборатории. При этом выборе возникают следующие вопросы; как готовить, фиксировать и обрабатывать препараты тканей? Какие антитела и какую систему иммунодетекции использовать? Такое разнообразие методов дает большие преимущества при проведении научных исследований, но их использование в диагностических целях сопряжено с рядом ограничений, и выбор оказывается не таким уж большим. Выбирая тот или иной иммуноцитохимический метод для рутинной диагностики, учитывают следующие факторы.

а.  Чувствительность.

Чувствительный метод позволяет выявлять даже небольшие количества антигена при минимальном  фоновом окрашивании. Это зависит от авидности, аффинности и титра первых антител, а также от чувствительности метода детекции. Конечно, для точной диагностики лучше пользоваться высокочувствительными методами, но при выборе приходится учитывать их стоимость и быстроту.

б.  Достоверность и воспроизводимость результатов.

При рутинном тестировании гораздо важнее воспроизводимость результатов, чем чувствительность метода. Так, простой метод, который состоит из небольшого числа процедур и использует обычные реактивы, дает меньше ошибок.

в.   Стоимость.

С учетом стоимости реактивов и оборудования, а также времени, затрачиваемого на тестирование, иммуноцитохимические анализы могут быть довольно дорогими. Снизить их стоимость без ухудшения результатов может тщательный предварительный отбор.

г.   Универсальность.

Метод должен быть пригоден для анализа всех типов тканей и их препаратов.

д.   Возможность автоматизации и окрашивания партий препаратов.

е.   Безопасность.

Выбор метода может зависеть и от личных предпочтений исследователя.


3. Изготовление препаратов

Как правило, в диагностических лабораториях для анализа используют кусочки ткани, фиксированные формалином, залитые в парафин и нарезанные с помощью стеклянного ножа. Эта схема применяется десятки лет и была разработана исходя из того, что гистопатологи используют для диагностики исключительно морфологические критерии. Для иммуноцитохимиков, которых интересуют биологические характеристики препарата, она может оказаться неприемлемой. Главная проблема состоит в том, что при заливке в парафин и последующем изготовлении срезов могут разрушиться как раз те компоненты ткани, которые хотят исследовать. Так, возможна полная или частичная утрата этих компонентов, их химические изменения, маскирование антигена. Совершенство системы иммуномечения или уникальность первых антител не имеют значения, если антиген утрачен или не доступен для антитела.

Следовательно, важно помнить, что круг антигенов, которые можно выявить на парафиновых срезах, уже, чем на замороженных. Поэтому решение вопроса о том, фиксировать или замораживать препарат, зависит от выявляемых антигенов.


3.1. Тканевые срезы


3.1.1. Изготовление препаратов

Процедура фиксации или замораживания препаратов для ИЦХ должна быть очень быстрой, чтобы максимально сохранить антигенные компоненты и морфологию ткани и не допустить лизиса клеток, приводящего к потере и диффузии антигенов.

Большинство хирургических биоптатов, если они хранятся нефиксированными в течение 24 ч при температуре 4 С, остаются интактными. Очень маленькие биоптаты, которые исследуют в нефиксированном виде, необходимо предохранять от высыхания. Их транспортируют, завернув в смоченную солевым раствором марлю или поместив в специальную среду. ИЦХ-методами можно исследовать также образцы ткани, полученные при аутопсии, при этом чем быстрее начат анализ, тем лучше результаты. Ряд антигенов, например некоторые онкогенные белки или факторы роста, сохраняют целостность только при немедленном замораживании препарата.


3.1.2. Качество срезов

При любом способе приготовления срезы должны быть ровными, достаточно тонкими, однородными по толщине; помещать их нужно на чистые предметные стекла. Надорванные или «жатые» срезы должны быть отбракованы, поскольку все эти неоднородности затрудняют интерпретацию результатов.


3.1.3. Прикрепление срезов к предметным стеклам

Серьезной проблемой является потеря тканевых срезов во время окрашивания. Вероятность потерь высококачественных и достаточно сухих срезов меньше, но при работе с некоторыми тканями и длительных исследованиях она остается весьма высокой. В таких случаях можно покрывать стекла специальными адгезивами, не влияющими на последующие процедуры.

Обычно при работе со срезами, приготовленными методом замораживания-высушивания, и с парафиновыми срезами, которые легко отделяются от подложки, мы покрываем стекла желатиной с алюмохромовыми квасцами. Плохо прилипают к стеклу ткани, подвергнутые кислотной декальцификации или недостаточно хорошо обработанные. Методика покрытия стекол желатиной с алюмохромовыми квасцами описана в протоколе 2.1. Если срезы предварительно обрабатывают протеолитическими ферментами, то желатинового покрытия может оказаться недостаточно для прочного прилипания срезов. В таких случаях можно использовать более сильные адгезивы, например поли-L-лизин [1] или органосилан [2];


Протокол 2.1.

Покрытие предметных стекол желатиной с алюмохромовыми квасцами

1. Растворяют 2,5 г желатины в 500 мл дистиллированной воды, нагревая раствор до 50 °С при постоянном помешивании.

2. После растворения желатины добавляют 0,25 г алюмохромовых квасцов и хорошо перемешивают раствор.

3. Охлаждают раствор до комнатной температуры и хранят его при 4 °С.

4. Перед использованием нагревают раствор до 60 °С и фильтруют в химический стакан.

5. Погружают в раствор чистые предметные стекла, не касаясь их поверхностей. Вынимают стекла, помещают их на подставку и сушат в термостате при 60 °С не менее 1 ч. После охлаждения стекла можно хранить в коробках при комнатной температуре.


3.1.4. Криостатные срезы

Криостатные срезы лучше других подходят для выявления широкого спектра антигенов, однако при этом необходимо, чтобы образцы тканей были получены и хранились соответствующим образом, а в ходе фиксации и приготовления срезов не нарушилась морфология ткани и сохранились антигены. Процедура приготовления криостатных срезов описана в протоколе 2.2.


а. Замораживание и хранение образцов

Идеальными для получения криостатных срезов являются образцы ткани размером не более 10 х 10 х 5 мм, маркированные и быстро замороженные в жидком азоте. Иногда для ускорения замораживания применяют изопентан, охлажденный в жидком азоте. Большинство лабораторий пренебрегают этим приемом, однако если есть опасность физической деформации ткани (например, мышечной), такая процедура может оказаться весьма полезной. Замороженные образцы следует хранить в жидком азоте или в морозильнике при -70°С, а во время приготовления срезов температура не должна превышать -20°С. Необходимо иметь в виду, что при длительном хранении образцов ткани при низкой температуре происходит их усыхание.

На наш взгляд, замороженные ткани лучше всего держать в плотно закрытых пластиковых флаконах. Кусочек ткани помещают во флакон таким образом, чтобы его не пришлось размораживать перед приготовлением срезов, и заливают средой, обеспечивающей оптимальные условия разрезания при данной температуре (optimal cutting temperature, ОСТ, Miles Scientific, UK). Затем флакон маркируют, быстро замораживают и оставляют на хранение. Этот способ позволяет избежать отбора неоправданно больших образцов тканей и свести к минимуму их усыхание. По мере необходимости образцы вынимают из морозильника и сразу же помещают в криостат для приготовления срезов. Когда температура повысится до -20 °С, кусочек ткани вместе с заливочной средой вынимают из флакона и закрепляют в держателе с соответствующей ОСТ. Чтобы не возникало проблем с выниманием ткани, лучше не пользоваться круглодонными флаконами с резьбой; оптимальными являются полиэтиленовые флаконы объемом 2,5 мл фирмы Kartell, UK. После приготовления срезов оставшийся кусочек ткани вновь помещают во флакон, заливают ОСТ и хранят в жидком азоте.


б. Приготовление срезов

Чаще всего работают со срезами толщиной 4-6 мкм. Приготовленные срезы помещают на стекло и высушивают на воздухе при комнатной температуре не менее 30 мин, а при температуре 4 °С — до 24 ч. Если срезы не окрашены, то стекла заворачивают в алюминиевую фольгу попарно, срезами наружу, и помещают в холодильник. При —20 °С срезы можно хранить месяцы и даже годы. Когда понадобится проводить иммуноцитохимический анализ, стекла вынимают из холодильника, не разворачивая фольгу до тех пор, пока стекла не прогреются до комнатной температуры. Это позволяет избежать скапливания на стеклах конденсата, заметно изменяющего морфологию ткани. Подобным способом с небольшими модификациями можно готовить замороженные срезы любых тканей. Иногда уменьшают время высушивания, чтобы сохранить особенно неустойчивые антигены. Определенные трудности возникают при приготовлении срезов трепанобиоптатов костного мозга, которые применяют при исследовании лейкозов и других гематологических нарушений. Если костный мозг гиперклеточный, то образцы можно обрабатывать точно так же, как другие ткани, и резать обычным стальным ножом. Твердую костную ткань — если она присутствует в образце в большом количестве - лучше удалить, поскольку она не представляет интереса для анализа.

Спикулы, пронизывающие костный мозг, обычно хорошо режутся, хотя и при более низкой температуре. Чтобы срезы получались более качественными, кусочек ткани следует ориентировать под прямым углом к режущей кромке ножа. Это особенно важно, когда для получения срезов хорошего качества требуется прочное их прилипание к стеклу и когда срезы делают острым лезвием бритвы. Использование агентов, удаляющих из тканей кальций, необязательно и может только ухудшить их антигенные свойства и морфологию. Разработанный метод удаления кальция [3] требует продолжительного времени и не очень удобен для диагностических исследований. Если не удается получить удовлетворительные срезы, то лучше использовать для ИЦХ-анализа «столбики» трепанобиоптатов. Их готовят, как любые другие цитологические препараты (разд. 3.2), но, конечно, до замораживания трепанобиоптата. Когда нужны более толстые замороженные срезы, можно использовать свободно плавающие срезы, сделанные на замораживающем микротоме. Окрашивание таких срезов улучшает их проницаемость для антител, но при этом может понадобиться дополнительная обработка срезов, например детергентами.

Не следует делать замороженные срезы, если имеются хоть какие-то подозрения на присутствие в ткани инфекционных агентов. Таких агентов можно выявить окрашиванием фиксированных и заключенных в парафин тканей, и если они обнаружены, то необходимо провести дезинфекцию или вообще отказаться от приготовления срезов. При исследовании тканей больных, инфицированных ВИЧ или другими вирусами, образцы обрабатывают бета-проприолактоном [4], который инактивирует вирусы, не влияя на антигенные свойства ткани.


в. Фиксация

Как показывает наш опыт, наилучшим фиксатором замороженных срезов является абсолютный ацетон; фиксацию проводят при комнатной температуре или при 4С. Срезы погружают в ацетон на 10 мин, а затем высушивают на воздухе. Антитела или блокирующие вещества наносят непосредственно на сухой срез. Для лучшего сохранения морфологии ткани и некоторых антигенов разработано несколько альтернативных способов с использованием смеси периодата натрия, лизина и параформальдегида [5,6]. Ценность такой обработки состоит в том, что при этом можно транспортировать ткани до их фиксации [5].


Протокол 2.2.

Приготовление замороженных срезов для иммуноцитохимического анализа

1.Делают криостатные срезы быстрозамороженных кусочков тканей толщиной 5 мкм и высушивают их на воздухе. Если в течение суток срезы не будут окрашены, заворачивают предметные стекла в фольгу, надписывают и хранят при -20 °С. По мере надобности вынимают стекла из холодильника, разворачивая фольгу только после того, как стекла прогреются до комнатной температуры.

2. Указывают на стеклах названия антител, используемых для мечения.

3. В течение 10 мин фиксируют срезы на стеклах в ацетоне при комнатной температуре.

4. Высушивают стекла на воздухе. Антитела наносят прямо на сухой срез.



3.1.5. Парафиновые срезы

Как мы уже говорили, тканевые антигены могут утрачиваться на каждом этапе приготовления парафиновых срезов. И все же с помощью рутинных гистологических методов удается выявить достаточно большое число антигенов, что позволяет решать многие важные диагностические проблемы. Чтобы добиться лучшего окрашивания препаратов, следует иметь в виду несколько моментов.


а. Фиксация

Наиболее удобными гистологическими фиксаторами, позволяющими сохранить морфологию ткани, являются растворы на основе формалина. К сожалению, они отрицательно влияют на сохранность антигенов, особенно при длительной фиксации, но пока какой-либо замены формалину при проведении рутинных гистологических исследований не найдено. Если есть возможность получать свежие образцы ткани, то лучше использовать фиксаторы, наиболее подходящие для ИЦХ, например периодат-лизин-параформальдегид (ПЛП) и ПЛП-бихромат [7, 8].

Однако это предполагает, что специалист по молекулярной диагностике заранее знает, какие именно исследования ему предстоит проводить, а это бывает нечасто.Полагают, что одни антигены формалин разрушает полностью, число других при таком способе фиксации снижается незначительно, третьи маскируются. Один из способов расширения круга антигенов, поддающихся выявлению в фиксированных формалином и заключенных в парафин тканях, состоит в применении более чувствительного метода детекции, позволяющего обнаруживать даже незначительные количества антигенов, Другой подход заключается в обработке срезов протеолитическими ферментами до их иммуноокрашивания. Прежде чем рассматривать этот метод, стоит вкратце остановиться на механизме фиксации тканей формалином. В его основе лежит образование метиленовых мостиков между аминогруппами белков. Такое поперечное сшивание может маскировать те участки молекул, которые должны были бы связаться с антителами; именно для разрушения сшивок срезы и обрабатывают ферментами.

Обработка протеолитическими ферментами.

Для этой цели используют несколько ферментов. Среди них:


*Трипсин

*Протеаза

*Пепсин

*Протеиназа К

*Проназа[9]

*Фицин[10]


Выбор фермента зависит от:

•   времени фиксации;

•   характера фиксирующего агента;

•   выявляемого антигена.

Ферментативная обработка необходима не всегда. Она неприемлема, если нужно выявить антигены, разрушающиеся при протеолизе. В любом случае ее следует проводить с осторожностью, поскольку слишком длительная инкубация срезов с ферментом ухудшает качество окрашивания и изменяет морфологию ткани. Кроме того, для лучшей повторяемости результатов необходимо помнить следующее:

•  нужно использовать свежеприготовленные растворы, а фермент добавлять в предварительно прогретый раствор;

•  прежде чем наносить на предметные стекла раствор с ферментом, их необходимо прогреть до нужной температуры;

•  для прогрева растворов и их хранения лучше использовать водяную баню, а не термостат.



Протокол 2.3.

Обработка протеолитическими ферментами парафиновых срезов тканей, фиксированных формалином

Материалы

• Раствор трипсина: 0,1% (в/о) трипсин типа II (ICN Biochemicals 150213) в 0,1% СаСI2, рН 7,8 (рН доводят с помощью 0,1% NaOH или 2% НСI). Прежде чем добавлять трипсин, прогревают раствор СаСI2 до 37°С не менее 15 мин в водяной бане. Трипсин хранят при 4°С

•  Раствор протеазы; 0,0125% (в/о) бактериальная протеаза типа -XXIV (Sigma P-8038) в буфере 50 мМ трис-НС1, 100 мМ NaCl, рН 7,6 (ТСБ) при 37°С. Протеазу хранят в сухом виде при температуре ниже 0°С. Прежде чем добавлять ее, буфер прогревают не менее 15 мин в водяной бане

•Раствор пепсина: 0,4% (в/о) пепсин (Sigma Р-7012) в 0,01 М НС1, рН 2,0


Методика

1. Готовят по обычной методике гистологические срезы толщиной 4-5 мкм. Высушивают их при 37 °С в течение ночи или при 60 °С в течение 1 ч. Надписывают стекла, указывая наносимые на срезы антитела.

2. Удаляют парафин со срезов в трех сменах ксилола, по 2 мин в каждой смене.

3. Проводят срезы через батарею спиртов, 100%, 100%, 70%, по 2 мин в каждом.

4. Тщательно промывают срезы водопроводной водой, а затем споласкивают в дистиллированной воде.

5. Прогревают срезы в дистиллированной воде при 37 °С в течение 5—10 мин.

6. Стряхивают со стекол воду и помещают их в раствор трипсина, протеазы или пепсина,

7. Останавливают ферментативную обработку, опустив стекла со срезами в дистиллированную воду, а затем в ТСБ. Антитела и блокирующий раствор следует наносить на влажные, а не на сухие срезы.

Продолжительность протеолитической обработки зависит от перечисленных выше факторов. Кроме того, иногда нужно учитывать и длительность фиксации ткани. Поэтому для каждого из антител необходимо проводить пробные обработки, с тем, чтобы подобрать оптимальные условия протеолиза в тканях, приготовленных обычным способом. Если условия приготовления отличались от стандартных, требуются дополнительные предварительные исследования.


При фиксации тканей отличными от формалина фиксирующими агентами протеолиз может оказаться необязательным благодаря другому механизму фиксации. Более того, обработка ферментами может быть даже противопоказана. Так, при фиксации агентом Карнуа фермент полностью изменяет морфологию ткани. Поэтому при проведении молекулярно-диагностических тестов следует помечать кусочки тканей, не фиксированных формалином, особенно если предполагается провести ИЦХ-анализ.


б. Выбор блока ткани

Лучше всего окрашиваются свежефиксированные, маленькие или среднего размера кусочки (блоки) ткани. Кроме того, для их окраски требуется меньше реактивов. Когда имеется большой блок ткани, но предполагается исследовать лишь его часть или если ткань гомогенна, следует разрезать блок на несколько кусочков, удобных для работы.


в. Высушивание срезов

При высокой температуре или длительном нагревании антигены могут денатурировать. Обычно для высушивания при 37 °С достаточно 8—24 ч. Если требуется провести срочный анализ, можно прогреть срезы при 60 °С в течение 15—60 мин. При выявлении особенно нестабильных антигенов высушивание лучше проводить при комнатной температуре.


г. Депарафинирование

Как и при всех способах окрашивания, очень важно полностью удалить со срезов парафин и соответствующие растворители. Если на срезах останутся следы парафина, то не все антитела смогут проникнуть в ткань и срез окрасится неравномерно.

Парафин удаляют в трех сменах ксилола, по 2 мин в каждом. Если используются растворители на основе эфирных масел цитрусовых, то стекла выдерживают в них дольше. Перед тем как промыть срезы водой, их следует провести через три смены спиртов (100%, 100%, 70%), по 2 мин в каждой.


д. Хранение блоков тканей

Блоки, залитые в парафин, хорошо хранятся при комнатной температуре. На устойчивых к формалину антигенах такое хранение не сказывается или сказывается очень незначительно. Можно привести примеры целого ряда успешных исследований блоков ткани, зафиксированных 30 лет назад [13, 14] или хранящихся даже более 150 лет.


е. Декальцификация

Приготовление качественных срезов осложняется наличием в тканях, особенно в костной, солей кальция, которые желательно удалить после фиксации. Для этого имеется широкий выбор реактивов, различающихся по своей способности влиять на сохранность антигенов. Как правило, большинство антигенов сохраняется в присутствии хелатирующих веществ. Приемлема и непродолжительная обработка некоторыми кислотами [15, 16].


3.1.6. Альтернативные методы получения срезов

Разработан ряд методов получения срезов, позволяющих сохранить гистологические свойства тканей в такой же степени, как в фиксированном формалином материале, и их антигенный состав -как в криостатных срезах. Помимо методов, в которых используются альтернативные фиксаторы, представляет интерес метод лиофилизации.


а. Срезы, полученные из лиофилизованных блоков

Ткани замораживают, лиофилизуют и заключают в парафин. Срезы таких блоков можно готовить так же, как срезы любого парафинового блока. Поскольку фиксация и обработка растворителями не проводится, в залитой в парафин ткани сохраняется значительно больше антигенов и не изменяется морфология [17].

При резке таких парафиновых блоков требуется особая осторожность, поскольку ткани становятся хрупкими. Готовые срезы плавают в ванночке с водой (но не со спиртом) при температуре 25-28 °С. Срезы можно осторожно расправить на прогретом столике, а затем подсушить при температуре 37 °С. Залитые в парафин блоки ткани можно хранить при комнатной температуре, однако в случае длительного хранения лучше держать их при температуре от -20 до +4 °С. Аналогично, если срезы не будут использованы сразу после высушивания, их хранят при -20°С точно так же, как замороженные срезы.


б. Срезы, заключенные в смолу

Долгое время считалось, что для проведения ИЦХ нельзя использовать срезы тканей, заключенных в гликольметакрилат (ГМА). Однако оказалось, что при соответствующих модификациях этого метода в тканях сохраняется достаточно много антигенов. Результаты получаются лучше, если образцы обрабатывают при низкой температуре. Имеют значение также типы используемых фиксатора, смолы, катализаторов и пластификаторов [9, 18—21]. В связи с небольшой толщиной получающихся срезов лучше применять высокочувствительные методы детекции, а также обрабатывать срезы протеолитическими ферментами.


3.2. Мазки

Иммуноцитохимические методы — полезное подспорье для идентификации клеток крови и тканевых жидкостей, а также для исследования препаратов, полученных при хонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ).


3.2.1. Изготовление препаратов

Препараты для ИЦХ могут быть трех типов:

а) отпечатки; б) мазки, полученные подходящими цитологическими или гематологическими методами; в) препараты, полученные центрифугированием клеточных суспензий. Последний метод предпочтителен, когда в распоряжении исследователя имеются биологические жидкости с небольшим количеством клеток, жидкости, полученные методом ТАБ или содержащие много белка, который нужно отмыть перед иммуноокрашиванием. Основные этапы приготовления препаратов для ИЦХ описаны в протоколах 2.4 и 2.5.


Протокол 2.4.

Центрифугирование материала, полученного методом ТАБ*)

1. Собирают материал, полученный при тонкоигольной аспирационной биопсии, в среду RPMI (Gibco, UK).

2. Центрифугируют при 600 g в течение 5 мин.

З.Удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл этой среды**).

4. С помощью лабораторной центрифуги (например, cytospine machine фирмы Shandon, UK) при скорости 550 об./мин наносят суспензию на предметные стекла (из 3 мкл суспензии получают 12 препаратов, по 250 мкл на препарат).

5. Высушивают стекла и, если не требуется срочного окрашивания, хранят их при —20 °С завернутыми в алюминиевую фольгу.

*)Аналогичные процедуры, за исключением п. 1, можно использовать при работе с другими цитологическими жидкостями.

**) Если в образце содержится много сывороточных белков, желательно промыть клетки еще раз, т. е. повторить шт. 2 и 3.

Когда концентрация клеток в образцах велика и особенно когда образуются агрегаты, затрудняющие приготовление мазков, заключают клеточный препарат в агар, фиксируют формалином, проводят через парафин и готовят срезы, как в случае парафиновых блоков. Иногда (аспираты костного мозга или препараты ТАБ) формируют из клеток «шарик», заключают его в ОСТ, замораживают и готовят криостатные срезы. Заметим, что препараты из некротизированных тканей и препараты с большим содержанием эритроцитов или со следами мокроты, как правило, малопригодны для проведения иммуноцитохимического анализа.


3.2.2. Фиксация

Для исследования клеточных мазков с помощью ИЦХ используют следующие фиксаторы:

• Ацетон

• Эфир/спирт

• Метанол

• Ацетон/фосфатно-солевой буфер (ФСБ)

• Этанол

• Ацетон /Ф С Б/формалин

• Формалин

• Ацетон/цитратный буфер

Тип реактива и продолжительность обработки зависят от природы исследуемых антигенов. Наш опыт показывает, что лучше остановиться на несложном универсальном методе с одинаковым режимом обработки всех цитологических препаратов. Мы фиксируем препараты в смеси ацетон : метанол (1:1, о/о) в течение 90 с или - для лучшего сохранения морфологии — в смеси ацетон : метанол : формалин (19 : 19 : 2, о/о). После фиксации предметные стекла промываем в двух сменах триса или ФСБ не менее 5 мин.

Не следует фиксировать влажные препараты, поскольку продолжительное воздействие спиртовых растворов может повлиять на антигенные свойства тканей.


Протокол 2.5.

Изготовление цитологических препаратов для иммуноцитохимии

1. Высушенные на воздухе мазки или препараты, полученные центрифугированием клеточных суспензий, обрабатывают рутинным способом. Если их не предполагается окрасить в течение суток, стекла заворачивают в фольгу, надписывают и хранят при -20 °С. По мере надобности вынимают стекла из холодильника, не разворачивая фольги, пока они не прогреются до комнатной температуры.

2. Помечают на стеклах, какие антитела используются. С помощью алмазного маркера, стеклографа или специального иммуноцитохимического карандаша (Dako) обводят препарат в кружок.

3. Фиксируют препараты в смеси ацетон : метанол (50 : 50) при комнатной температуре в течение 2 мин.

4. Промывают стекла в ТСБ, рН 7,6, в течение 2 мин. Перед нанесением на препарат антител или блокирующей сыворотки удаляют излишки буфера.


4. Первые антитела

В распоряжении исследователей имеется богатый выбор антител к антигенам тканей человека. Многие из них уже давно используются для диагностики, другие лишь недавно охарактеризованы и только вводятся в практику. Заинтересованный читатель найдет многочисленные примеры их использования в работах [22, 23].

Выбор антител для целей диагностики зависит от того, какую именно патологию предполагается выявить. Другой важный критерий — стоимость. Необходимо также учитывать специфичность и титр антитела, его сродство (аффинность) к антигену-мишени.


4.1. Проверка антител

Если вы только приступаете к работе с данным антителом, необходимо:

а)   определить специфичность антитела; для этого полезно использовать блоки замороженных или заключенных в парафин тканей [24-26];

б)  определить подходящую рабочую концентрацию (разведение) для используемой системы иммуномечения;

в)  выбрать режим фиксации и обработки ткани, включая про-теолиз; лучше использовать фиксаторы, наиболее употребительные в данной лаборатории.


4.2. Хранение антител и работа с ними

К антителам, имеющимся в продаже, прилагается инструкция, в которой указаны условия их хранения, оптимальные для поддержания активности. Не обязательно хранить все антитела при 4°С, некоторые из них лучше держать при -20 °С, разлив препарат после предварительного анализа свойств антител в подходящие емкости. С одной стороны, хранение при 4°С может отрицательно сказаться на целостности антител, а с другой — повторное замораживание и оттаивание препарата приводит к еще более быстрому их разрушению.


5. Системы иммуномечения

Разрабатывая и совершенствуя системы иммунномечения, преследуют две цели: а) повышение чувствительности методов визуализации сайтов связывания антител с антигенами; б) создание более универсальных методов. Для этого можно использовать более легко обнаруживаемые метки или применять методику связывания с каждым антигеном большего количества метки.


5.1. Выбор системы иммуномечения

Наиболее простая процедура состоит в непосредственной конъюгации метки с антителом (или антителами) к данному антигену и нанесении конъюгата на срез в один прием прямым методом.


Рис. 2.1. Прямой и непрямой методы иммуномечения.



Этот метод довольно прост, но не очень чувствителен; кроме того, при работе с данной антисывороткой можно использовать только один метод. Известен и другой, более совершенный непрямой метод. В этом случае тканевые срезы инкубируют с немечеными первыми антителами, а затем — со вторыми, мечеными антителами к видам — донорам первой антисыворотки. Такой метод позволяет использовать одно меченое антитело с большим числом первых антител при условии, что последние происходят от одного вида. Поскольку с первым антителом связывается целый ряд антител из второй антисыворотки, чувствительность метода возрастает. Чувствительность можно также повысить, используя третий компонент, меченое антитело к виду — донору второй антисыворотки. Это так называемый трехэтапный, или усиленный непрямой метод (рис. 2.1).

Разработаны и другие системы иммунномечения. Одни из них используются довольно часто, другие — только в исследовательских целях, но представляют несомненный интерес для молекулярной клинической диагностики.


5.1.1. Пероксидазэ—антиперокеидаза (ПАП) и щелочная фосфатаза—антищелочная фосфатаза (ЩФАЩФ)

В этих двух методах используется растворимый иммуноферментный комплекс, который образуется благодаря сродству меченого фермента к «своему» антителу.




Рис. 2.2. Мечение с использованием пероксидазы—антипероксидазы и щелочной фосфатазы—антищелочной фосфатазы.



Чтобы второе антитело (так называемое антитело-мостик) могло обеспечить связывание первого антитела с антителом комплекса, необходимо, чтобы последнее происходило от того же донора, что и первое. Антитела-мостики должны присутствовать в избытке, чтобы после их связывания с первыми антителами их второй Fab-участок оставался свободным для связывания с антителами комплекса (рис. 2.2).

Оба эти метода обладают такой же чувствительностью, как любой трехэтапный метод; их чувствительность можно повысить, вновь нанося второй и третий слои. Продолжительность этих инкубации может быть меньшей, чем для первых стадий, а наслаивание антител можно проводить столько раз, сколько нужно для оптимального окрашивания. Пользуясь методом ЩФАЩФ, мы обычно проводим два цикла окрашивания, а для антигенов, присутствующих в ткани в малых количествах, — три или четыре цикла.


5.1.2. Авидин-биотиновые и стрептавидин-биотиновые системы

В основе этих методов лежит сродство авидина и стрептавидина к небольшому белку биотину, четыре молекулы которого связываются с одной авидиновой (или стрептавидиновой) молекулой. Обычно эти системы применяются в ИЦХ одним из двух способов: на последнем этапе используется либо меченый авидин, либо комплекс между меченым биотином и авидином.

В обоих случаях необходимы антител а-мостики к видам, от которых получены первые антитела, способные ковалентно связываться с биотином (рис. 2.3). Оба метода достаточно чувствительны и обычно в них используются меченые ферменты. Стрептавидиновый метод имеет то преимущество перед авидиновым, что изоэлектрическая точка стрептавидина близка к нейтральной, а, следовательно, неспецифическое связывание стрептавидина с заряженными группами в тканях практически отсутствует.




Рис. 2.3 Авидин-биотиновые системы



Поскольку стрептавидин- это белок, а не гликопротеин, он не связывается с тканевыми лектинами. Что касается авидина, то он связывается не только с эндогенными ферментами, но и с эндогенным биотином, что создает особенно серьезные проблемы при работе со срезами печени и почек, в первую очередь с замороженными, но не заключенными в парафин тканями. Такое связывание блокируют 20-минутной инкубацией срезов в 0,1% авидине и последующей 20-минутной инкубацией в 0,01% биотине [27]. Имеются сообщения и о неспецифическом связывании авидина с поверхностными антигенами гепатоцитов, инфицированных вирусом гепатита В [28].



5.2. Выбор метки

Метка необходима для визуализации места связывания антигена с антителом.

В молекулярной клинической диагностике используется целый ряд меток; все они имеют как преимущества, так и недостатки (табл. 2.1). Три из них широко используются уже несколько лет, а четвертая стала применяться лишь недавно.



Таблица 2.1. Метки, использующиеся в иммуноцитохимии

Тип метки

Преимущества

Недостатки

Примеры

Флуоресцентный краситель

· Светочувствительность

· Быстрота определения

·Необходим специальный микроскоп   

·Нестабильные препараты

·Трудно провести  корреляцию с морфологией ткани

· Флуоресцеинизо-тиоционат

· Родамин

· Фикоэритрин

· Техасский красный

· Диэтиламинокумарин (ДАМК)

Ферменты

· Стабильные препараты

· Не нужен специальный  микроскоп

· Универсальность

·Наличие эндогенных ферментов

· Пероксидазахрена Щелочная фосфатаза Глюкозооксидаза

· бетта-Галактозидаза

· Цитохромоксидаза

Металлы

· Высокая чувствительность

· Дорогие реактивы

·Проблемы с усилением серебром

· Коллоидное золото

Металлопротеины


· Используются в основном в электронной микроскопии


Радиоизотопы


· Используются в основном  в научных исследованиях

·         Ферритин

·         131I

·         35S

·         32P

·         14C





5.2.1. Флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ)

Флуоресцентные красители не нашли широкого применения в молекулярной клинической диагностике в основном из-за невозможности приготовления стабильных препаратов, необходимости использования флуоресцентного микроскопа и проблем с установлением корреляции между наблюдаемой картиной и морфологией. Однако благодаря своей чувствительности и простоте ФИТЦ-метод часто используют как в прямых, так и в непрямых системах детекции иммуноглобулинов, в частности при диагностировании буллезных поражений или гломерулонефропатий.


5.2.2. Пероксидаза хрена

При имуномечении широко используются конъюгаты антител и других реагентов с пероксидазой хрена (ПХ). Сам по себе этот фермент невидим, но его легко визуализировать с помощью простых гистохимических процедур, в которых используются Н2О2 в качестве субстрата и следующие колориметрические реактивы:

•   3,3'-диаминобензидин

•  З-амино-9-этилкарбазол

•  4-хлор-1-нафтол

•  n-фенилендиаминпирокатехол

•  тетраметилбензидин

•  гомованиловая кислота

•  нафтолпиронин

В присутствии диаминобензидина (ДАБ) образуется не растворимый в органических растворителях продукт. Это позволяет заключать препараты в синтетические среды и стабилизировать их, чем и объясняется популярность данного хромогена. Цвет конечного продукта реакции с ДАБ можно усилить или изменить с помощью различных солей тяжелых металлов. Такой способ повышает чувствительность метода и применяется при двойном мечении.

Усиливающие реактивы можно либо добавлять в раствор ДАБ, либо дополнительно обрабатывать ими препараты после инкубации с ДАБ [29—31]. Мы получали хорошие результаты, добавляя к раствору ДАБ/Н2О2 хлорид никеля (NiCI2*6Н2О) в концентрации 1 мг/мл.

Одна из проблем, возникающих при работе с ПХ, конъюгированной с антителами, состоит в том, что при этом визуализируется и эндогенный фермент тканей, например ПХ, содержащаяся в эритроцитах, полиморфноядерных лимфоцитах и макрофагах.

В большинстве случаев эндогенный фермент удается удалить, предварительно обработав препараты следующими реактивами:

• 3% пероксидом водорода в дистиллированной воде в течение 5-10 мин или 0,3-0,6% метанолом в течение 10-30 мин;

•  подкисленным спиртом;

•  0,01% фенилгидразином в течение 30 мин;

•  азидом натрия;

•  цианидом натрия;

•  феррицианидом калия;

•  1 % нитроферрицианидом в метаноле;

•  пикриновой кислотой.


Если необходима срочная окраска препаратов, то после протеолиза и перед окрашиванием с помощью иммунной метки мы обрабатываем препараты 3% Н202в течение 5 мин. Если позволяет время и окрашивается целая партия препаратов, то используется 30-минутная обработка 0,6% Н2О2 в 80% метаноле. В обоих случаях для удаления из срезов следов эндогенной пероксидазы их можно повторно обработать блокирующими растворами. Такие растворы могут неблагоприятно влиять на тканевые антигены, особенно в замороженных срезах и мазках. Чтобы избежать этого, уменьшают время инкубации с Н2О2 или обрабатывают препараты пероксидом после инкубации их с первым антителом. Однако, как показывает наш опыт, ни один из этих способов не обеспечивает полной сохранности морфологии тканей. Часто эндогенный фермент обнаруживается в виде темно-коричневых гранул и его легко отличать от светло-коричневых пятен пероксидазы в системе имунномечения, однако это не решает проблемы, когда исследуемые клетки содержат слишком много эндогенного фермента.


Можно попытаться использовать в качестве субстрата n-фенилендиаминпирокатехол (ФДП), поскольку он выявляет только ферменты растительного происхождения, в том числе пероксидазу хрена. Однако широкое использование этого реактива в качестве альтернативы ДАБ ограничивается нестабильностью его растворов.

Другой подход состоит в выявлении эндогенного фермента с помощью одного субстрата, а иммуномеченой пероксидазы — с помощью реактива другого цвета. Для рутинных измерений эта процедура слишком сложна, поэтому при большом содержании эндогенного фермента и невозможности его устранения лучше использовать альтернативное мечение.

Возможно, в будущем для пероксидазы будут использоваться и другие субстраты — либо в качестве альтернативы ДАБ, либо для двойного мечения. Несколько методов выявления ПХ приведены в протоколе 2.6.



Протокол 2.6.

Выявление пероксидазы хрена


Метод 1. Диаминобензидин (ДАБ)*

1. Промывают срезы в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.

2. Растворяют 25 мг 3,3-диаминобензидинтетрахлорида (ДАБ) в 50 мл ТСБ, рН 7,6. Непосредственно перед использованием этого раствора добавляют к нему 160 мкл 3% пероксида водорода (10 объемов), хорошо перемешивают и либо погружают предметные стекла в сосуд с раствором, либо отфильтровывают раствор на стекла, лежащие в инкубационном лотке **).

3. Инкубируют препараты 3—5 мин при комнатной температуре.

4. Тщательно промывают стекла в проточной воде.

5. Окрашивают препараты гематоксилином, дифференцируют и промывают в проточной воде по Скотту до получения синей окраски.

6. Высушивают препараты и заключают срезы в иммерсионную среду DPX (Depex). Пероксидаза выявляется в виде гранул коричневого цвета.



Метод 2. 3-амино-9-этилкарбазол (АЭК)

1. Промывают срезы в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.

2. Готовят два раствора для инкубации препаратов:

а) З-амино-9-этиленкарбазол 10 мг

Диметилформамид  2,5 мл

б)  Н2О2 (10 объемов) 0,2 мл

0,2 М ацетатный буфер, рН 5,0 50 мл

Смешивают эти два раствора и фильтруют на срезы. Инкубируют препараты до 20 мин при комнатной температуре.

3. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

4. Слегка контрастируют водным раствором гематоксилина (например, фирмы Mayer), дифференцируют до получения синей окраски, но не в подкисленном спирте, поскольку он растворяет АЭК.

5. Пероксидаза выявляется под водной иммерсией в виде гранул кирпично-красного цвета.


Метод 3.  4-хлор-1-нафтол

1. Промывают срезы в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.

2. Готовят раствор для инкубации препаратов:

а)  растворяют 30 мг 4-хлор-1-нафтола в 0,25 мл абсолютного этанола;

б)  добавляют 100 мл 0,05 М ТСБ, рН 7,6, к которому добавлено 50 мкл 30% Н2О2, и хорошо перемешивают;

в)  перед использованием этот раствор фильтруют.

3. Инкубируют препараты до 20 мин при комнатной температуре (контролируя окрашивание под микроскопом).

4. Тщательно промывают препараты в дистиллированной воде.

5. При необходимости контрастируют препараты. Пероксидаза выявляется под водной иммерсией в виде гранул темно-синего цвета.

*ДАБ получают от BDH (продукт под кодовым номером 13033). NB! Есть данные, что ДАБ обладает канцерогенными свойствами, поэтому при работе с ним нужно соблюдать меры предосторожности, например, надевать маску и резиновые перчатки.

**) Если окрашивание производится в сосуде Коплина или специальной емкости, то в одной смене раствора можно инкубировать две партии препаратов, а затем заменять раствор.



5.2.3. Щелочная фосфатаза (ЩФ)

Несмотря на то, что щелочная фосфатаза используется в иммуноцитохимии не так широко, как пероксидаза хрена, она занимает в иммуноцитохимических тестах важное место. На практике необязательно блокировать эндогенный фермент до инкубации препаратов с антисывороткой. Это можно сделать, добавив левамизол в концентрации 1—5 мМ прямо в среду, в которой растворен субстрат, поскольку кишечный фермент теленка, используемый в системе иммунодетекции, устойчив к действию левамизола. Однако в некоторых тканях, например в тканях пищеварительного тракта и плаценты, полностью блокировать активность эндогенного фермента бывает трудно. Когда не нужно проводить предварительную инкубацию, те антигены, которые могут разрушаться в процессе блокирования пероксидазы в замороженных срезах и мазках, легко обнаруживаются. Следует отметить, что растворы субстрата при работе со щелочной фосфатазой более сложные, чем в случае ДАБ, а окрашенные срезы нужно заключать в водную среду. Прекрасные и хорошо воспроизводимые результаты получаются с двумя растворами субстрата, приготовление которыхописано в протоколе 2.7. Раствор с новым фуксином/нафтол-AS-BI-фосфатом дает достаточно стабильную окраску, позволяющую заключать препараты в синтетическую среду, хотя при длительном хранении возможно их выцветание.


Протокол 2.7.

Субстраты для выявления ЩФ

Метод 1

1. Растворяют в стеклянной пробирке 2 мг нафтол-АБ-МХ-фос-фата (N-4875, Sigma) в 0,2 мл диметилформамида (ДМФ).

2. Добавляют к этому раствору 9,8 мл 0,1 М триса, рН 8,2.

3.Добавляют 10 мкл 1 М левамизола (L-9756, Sigma).

4. Непосредственно перед употреблением добавляют 10 мг быстрого красного TR™ (F-1500, Sigma), тщательно перемешивают и отфильтровывают на препараты*).

*)Для метода двойного мечения удобна синяя окраска препарата, поэтому заменяют быстрый красный TR на быстрый синий ВВ.


Метод 2

1. Готовят два раствора:

а)  в стеклянную пробирку с 0,5 мл свежеприготовленного 4% (в/о) нитрита натрия добавляют 0,2 мл 5% нового фуксина (CI 42520, R. Lamb) в 2М НС1, встряхивают 1 мин;

б)  в другой пробирке растворяют 50 мг нафтол-AS-ВI-фосфата (N-2250, Sigma) в 0,6 мл ДМФ.

2. К 100 мл 0,05М трис-HCl, рН 8,4—8,7, добавляют реактивы в такой последовательности:

•  100 мкл 1M левамизола

•  содержимое пробирки (а)

•  содержимое пробирки (б)

3. Тщательно перемешивают и отфильтровывают прямо на препараты.



6. Контроли

Для каждого иммуноцитохимического теста необходимо провести параллельный контрольный эксперимент. Следует убедиться в том, что отрицательный результат обусловлен именно отсутствием конкретного антигена, а не методическими ошибками. Аналогично, положительный результат должен быть обусловлен специфическим связыванием антитела, а не какими-то другими причинами. Поэтому в контроле нуждаются реагенты, ткани и все процедуры.


6.1. Контроль реагентов

Антитела, имеющиеся сейчас в продаже, имеют гораздо большую специфичность, чем препараты, выпускавшиеся ранее, и качество антител, предназначенных для диагностических целей, проверяется еще в процессе их производства. Поэтому при работе с новым препаратом антител остается только подобрать его оптимальную рабочую концентрацию, а также выбрать режим протеолиза на фиксированных и заключенных в среду срезах. Кроме того, нужно проверить ткани на неспецифическое окрашивание, не выявляющее соответствующий антиген. Дополнительный контроль абсорбции нужен только в том случае, если наблюдается перекрестное взаимодействие реагентов.

Если спустя какое-то время происходит снижение качества окрашивания данной партией препарата антитела, нужно еще раз проверить препарат, как это описано выше, и, возможно, подобрать новые условия работы с ним.


6.2. Контроль процедур

Такой контроль позволяет убедиться в правильности выполнения всех операций и в том, что реактивы не потеряли своей активности. Рассмотрим более подробно все аспекты этого контроля.


6.2.1. Тканевой контроль

Нужно убедиться, что используемое антитело сохраняет свою активность, поэтому каждый препарат первого антитела, используемый для окрашивания, проверяют на срезе ткани, заведомо содержащей интересующий нас антиген. Контрольный срез фиксируют и обрабатывают точно так же, как экспериментальный, и окрашивают его таким же способом, как исследуемые срезы. В случае положительного контроля используют ткани с низким или средним, но не с аномально высоким содержанием антигена. Это позволяет оценить чувствительность используемого метода. Если после окрашивания и тест, и контроль дают отрицательный результат, можно сделать вывод, что какие-то операции выполнены неправильно и необходима перепроверка (см. разд. 10). В некоторых случаях желательно провести отрицательный тканевой контроль, т. е. окрасить срез ткани, которая заведомо не содержит данного антигена, но обработана точно так же, как исследуемые срезы. Если контрольный срез окрашивается, то необходимо выяснить, почему. Обычно такой контроль не требуется, поскольку для достоверной оценки качества выбранных реактивов достаточно положительного контроля.

Для многих антигенов можно не проводить даже положительный тканевой контроль. Так, общий лейкоцитарный антиген, антиген, связанный с фактором VIII, виментин и другие антигены присутствуют во всех тканях и поэтому служат внутренним контролем для соответствующих им антител. Однако в тех лабораториях, где не окрашивают большие партии препаратов и антитела используются нерегулярно, положительный контроль необходим. Поддержанию высоких стандартов способствует постоянное участие лабораторий в Национальных программах гарантии качества.


6.2.2.   Контроль первых антител

Активность первых антител можно контролировать, заменив их неиммунным реактивом при обработке параллельных (контрольных) срезов. Существует несколько вариантов такой замены:

а) замена первыми антителами, которые были абсорбированы соответствующими очищенными антигенами;

б) замена посторонними («нейтральными») антителами;

в) замена неиммунной сывороткой, полученной от того же донора, что и первые антитела;

г)  первые антитела вообще не используют.

Первый вариант замены наиболее специфичен, но вследствие дороговизны очищенного антигена используется при рутинных исследованиях довольно редко. Второй вариант часто применяют в виде панели реактивов для диагностики. Третий и четвертый варианты при необходимости можно объединить. Для точности сравнения при выполнении операций (б) и (в) используют одинаковые концентрации иммуноглобулина и первого антитела.



6.2.3.   Контроль других реагентов

На сегодняшний день контроль реагентов, использующихся на втором и третьем этапах ИЦХ-анализа, обычно не требуется. Если наблюдается неспецифическое окрашивание, не обусловленное качеством первых антител, то можно провести серию тестов с заменой неиммунными реагентами (разд. 10).


7. За лабораторным столом

Выбрав подходящий иммуноцитохимический метод и подготовив препараты, можно начинать иммуноокрашивание. Многие методические детали отдельных операций мы уже рассмотрели; поясним теперь ряд общих моментов.


7.1.Оборудование и реактивы

Широкому распространению иммуноцитохимических методов способствовало то важное обстоятельство, что необходимое для этого оборудование имеется в любой лаборатории. Если предполагается работать с замороженными и парафиновыми срезами, есть приспособление для изготовления парафиновых срезов и криостат, то понадобятся следующие реактивы и оборудование.

•          Жидкий азот или морозильник на —70 °С

•          Морозильник на —20 °С

•          Холодильник на +4 °С

•          Камера для инкубации препаратов

•          Микропипетки от 5 мкл до 1 мл

•          Сосуды для окрашивания, сосуды Коплина, подставки для предметных стекол

•          Первые антитела и антитела для контроля

•          Антисыворотка со вторыми и третьими антителами и соответствующие реактивы

•          Нормальная (блокирующая) сыворотка

•          Реактивы для приготовления буферов и растворов субстратов

•          Красители для контрастирования срезов и среды для их заключения


7.2. Подготовка к окрашиванию

Прежде чем приступить к выполнению любого эксперимента, важно правильно организовать работу и предусмотреть все детали. Следует убедиться, что все антисыворотки, реактивы и оборудование имеются в наличии, а все препараты, включая контрольные, приготовлены и маркированы. Если срезы небольшие по площади, то полезно обвести их стеклографом, чтобы они были лучше видны на влажных стеклах. Препараты с нанесенными на них одинаковыми антителами при окрашивании в ванночке имеет смысл обрабатывать вместе. Следует сгруппировать по партиям и фиксированные формалином, заключенные в парафин препараты, одинаково обработанные протеолитическими ферментами.


7.3. Реагенты

В иммуноцитохимии не обращают внимания на правильность приготовления неиммунных реагентов. В то же время от свойств буферных растворов зависит ход иммунологических реакций. Буферы с неподходящим pH могут отрицательно повлиять на морфологию, особенно в цитологических мазках и замороженных срезах, которые фиксируются очень слабо, а также привести к отлипанию препаратов от предметного стекла. Как правило, нет необходимости каждый раз готовить свежий буферный раствор, но его следует правильно хранить. Старые маточные буферные растворы могут быть загрязнены грибами и другими микроорганизмами, которые проявятся на поверхности окрашиваемого среза.


7.4. Работа с препаратами

Убедитесь, что для окрашивания взято такое число стекол, с которым удобно работать. Новый метод лучше осваивать на небольшом числе препаратов и тщательно выполнять сами операции. В таком случае, если вас постигнет неудача, пропадет не слишком много реактивов и стекол. В дальнейшем для повышения эффективности работы можно обрабатывать ббльшие партии препаратов. Несмотря на то, что время обработки каждого препарата тем или иным реактивом остается прежним независимо от числа окрашиваемых препаратов, время, необходимое для завершения всей процедуры иммуноокрашивания, с увеличением этого числа возрастает. Можно уменьшить число стекол, помещая на одно стекло два или три среза (в зависимости от их размера). Отдельные срезы лучше обвести восковым карандашом. Это полезно делать и тогда, когда на стекле находится только один срез: вы сможете наносить реактивы локально и сэкономите дорогостоящие антитела. Небольшие срезы удобно помещать на специальные планшеты с ячейками. Однако если парафиновые срезы предполагается обрабатывать протеолитическими ферментами, следует наносить на одно стекло только те срезы, для которых режим протеолиза одинаков. Промывание и инкубацию препаратов с протеолитическими ферментами, а также блокирующие процедуры можно проводить в сосудах Коплина или в других емкостях объемом 200 мл. При окрашивании больших партий горизонтально расположенных стекол иммунопероксидазным методом с использованием в качестве субстрата ДАБ/Н2О2 это позволит уменьшить преципитацию на срезах. Инкубацию препаратов с субстратами для щелочной фосфатазы можно проводить в специальных ванночках, но это довольно дорого. Лучше отфильтровывать небольшие объемы реактивов прямо на предметные стекла, лежащие в инкубационной камере.


Чтобы срезы не отлипали, все процедуры следует проводить с осторожностью. Промывая стекла, нельзя сильно встряхивать их и направлять струю буфера на срез. Не следует наносить реагенты на срезы или мазки каплями с помощью пипетки, лучше аккуратно наслаивать их.


Во время инкубации препаратов с антителами и другими компонентами системы иммуномечения стекла нужно помещать в закрытую камеру горизонтально. При нанесении на препараты иммунологических реагентов важно удалять со стекла излишки буфера, которые могут уменьшить титр антител и ослабить окраску, однако во время окрашивания срезы не должны высыхать.


С учетом всего этого на каждый препарат лучше наносить не более 50—100 мкл разведенной антисыворотки.

Если в одном и том же режиме регулярно окрашивают большие партии препаратов, то для экономии реактивов лучше иметь контейнеры с разведенной антисывороткой, куда погружают стекла в штативе. Мы с успехом применяли такой способ для окрашивания препаратов с помощью ЩФАЩФ, пользуясь одними и теми же партиями реактивов несколько месяцев. В промежутках между экспериментами контейнеры с растворами лучше хранить в холодильнике, добавив в них азид натрия для предотвращения роста микроорганизмов.



7.5. Специальные красители и красители для контрастирования

Контрастирование проводят для облегчения локализации антигенов в тканях. Чаще всего в качестве контрастирующего вещества применяют гематоксилин. В тех случаях, когда субстрат дает спирторастворимый продукт, следует использовать водный раствор гематоксилина, например гематоксилин Мейера. Если продукт имеет синюю окраску, можно использовать метиленовый зеленый или нейтральный красный, хотя они не очень эффективны для водной иммерсии.


Контрастирующие агенты, среди которых наиболее широко применяется синий Эванса, можно применять вместе с флуоресцентной меткой.


Иногда на одних и тех же срезах проводят гистохимические реакции или дополнительно окрашивают их более сложными красителями, например трихромами. Такие методы должны давать контрастную окраску по сравнению с иммуноокрашиванием; кроме того, их можно применять, только если последовательные процедуры не сказываются отрицательно одна на другой.



7.6. Проблема нехватки материала

Когда весь образец ткани израсходован или когда не осталось лишнего материала от проб, взятых для цитологических исследований, прибегают к одному из следующих приемов.

а. Обесцвечивают имеющиеся препараты и окрашивают их заново. Результат повторного окрашивания зависит от природы выявляемого антигена, а также от характера предыдущей фиксации и схемы окрашивания. Несмотря на то, что некоторые устойчивые антигены, например цитокератины и общий лейкоцитарный антиген, могут сохраниться, использование высокочувствительной системы иммунодетекции позволяет решить проблему.

б. Фрагментируют имеющиеся препараты. На один срез или мазок можно нанести два или три разных антитела при условии, что те патологические изменения, которые интересуют исследователя, не локализованы в каком-то одном участке препарата. Стекло с препаратом разрезают на части с помощью алмазного стеклографа (хотя это может осложнить процедуры промывания и окрашивания). Можно разделить препарат на фрагменты с помощью специального иммунохимического воскового карандаша, ручки с флуоресцентными чернилами или аккуратной линией из расплавленного парафина. В каждом случае границу между фрагментами нужно предварительно осушить.

в. Двойное/тройное мечение (разд. 9).


7.7.  Совмещение иммуноцитохимического анализа с гибридизацией in situ

В некоторых случаях на одних и тех же срезах можно проводить и ИЦХ-анализ, и гибридизацию in situ ([36]; см. также гл. 4 и 7). Осуществимость такой комбинации зависит от влияния на исследуемые антигены тех процедур, которые применяются при гибридизации in situ. В настоящее время такое совмещение методов используется в целях молекулярной клинической диагностики довольно редко.


7.8. Автоматизация

Повторяемость операций, совершаемых при проведении им-муноцитохимических анализов, позволяет автоматизировать метод. Существуют как промышленные приборы для ИЦХ-анализа, так и лабораторные разработки [37, 38]. Выбор той или иной системы зависит от нескольких факторов:

а) качество окраски (чувствительность, воспроизводимость результатов) должно быть не хуже, чем для анализа «вручную»;

б) стоимость анализатора и соответствующих операций должна компенсироваться экономией времени и реактивов;

в) анализатор должен быть достаточно универсален, чтобы его можно было использовать при различных модификациях метода;

г) анализатор должен успешно справляться со всем объемом работ.

В каждой лаборатории эти моменты оцениваются самостоятельно. Но с увеличением объема работ и с появлением проблем, связанных с набором большого числа квалифицированных сотрудников, вопросы автоматизации становятся все более актуальными.



8. Улучшение качества иммуноокрашивания

Помимо использования новых антител и систем иммуноокрашивания, можно найти и другие способы улучшения качества окрашивания. При этом стремятся решить по меньшей мере одну из следующих задач:

а) получить более интенсивную окраску;

б) снизить стоимость метода, используя реактивы меньшей концентрации;

в) уменьшить время выполнения операций.


Чтобы решить эти задачи, нужно тщательно выполнять все операции и обращать особое внимание на сохранность антигена и морфологии препарата. Для этого необходимо:

• выбрать подходящий протеолитический фермент и правильную методику работы с ним;

• подобрать оптимальный режим блокирования активности эндогенных ферментов;

• правильно разводить препарат антител;

• тщательно готовить растворы субстратов и усилителей.


8.1. Время инкубации

Увеличивая время инкубации препаратов с первыми антителами или со вторыми реагентами, можно значительно повысить интенсивность окраски. В большинстве случаев рекомендуется инкубировать препараты 30—60 мин, но увеличение этого времени вдвое может дать очень хороший эффект. Как правило, рекомендуемое время инкубации нужно рассматривать как минимальное, но не как оптимальное или предельное. Инкубацию с первыми антителами можно проводить в течение нескольких часов, а при слабом выявлении антигенов оставлять препараты в инкубационной камере на ночь (при 4 °С, чтобы уменьшить испарение). При продолжительной инкубации иногда происходит отлипание срезов и подсыхание препаратов. Чтобы избежать этого, стекла помещают в камеру при достаточно высокой влажности в горизонтальном положении.


8.2. Температура инкубации

В большинстве случаев инкубацию препаратов с антисывороткой проводят при комнатной температуре (20—22 °С). Для повышения качества окрашивания иногда иммунологические реагенты подогревают и проводят инкубацию при более высокой температуре. При этом следует быть уверенным, что не происходят денатурация антител, потеря антигенов и деструкция ткани. Мы получали хорошие результаты при температуре 37 °С, однако имеются данные об успешной инкубации при температурах вплоть до 60 °С. Для хорошей воспроизводимости результатов необходимо предварительно прогревать инкубационную камеру и реактивы. В последнее время для этого используют микроволновую печь, что позволяет уменьшить время инкубации с широким кругом антител до 30 с [39].


8.3. Титр

Результат окрашивания в значительной степени зависит от концентрации первых антител и других иммунологических реактивов. Используя более концентрированные растворы, можно усилить интенсивность окраски, однако следует помнить о том, что при этом может повыситься фон.


8.4. Встряхивание

Положительный эффект нагревания во время инкубации препаратов, по-видимому, обусловливается увеличением скорости хаотического движения молекул антител, что повышает вероятность связывания их с антигенами. Аналогичный результат могло бы дать и встряхивание препаратов во время инкубации. Когда стекла лежат в инкубационной камере горизонтально, сделать это довольно трудно. Встряхивание применяется в некоторых автоматизированных системах и в тех случаях, когда окрашивание проводится в контейнерах.


8.5. Уменьшение неспецифического окрашивания

Антитела могут неспецифически связываться с реагентами, присутствующими на срезах, или заряженными группами. Такие нежелательные взаимодействия блокируют с помощью белковых препаратов, например неиммунной сыворотки, бычьего сывороточного альбумина (БСА) или сыворотки плода коровы (СПК),добавляя их к разведенным антителам или нанося на препараты до инкубации последних с антисывороткой.

Кроме того, неспецифическое окрашивание может возникать из-за присутствия в антисыворотке посторонних антител, которые можно удалить абсорбцией на измельченных или гомогенизированных экстрактах таких органов, как мозг или печень.

Антитела могут связываться и со свободными альдегидными группами. Такое неспецифическое связывание частично устраняют с помощью раствора боргидрида натрия.


8.6. Тканевые пигменты

В клетках, мазках или на тканевых срезах могут просутствовать пигменты, искажающие результаты ИЦХ. Иногда возникают проблемы, обусловленные осаждением на препаратах желчи, солей железа, липофусцина, углекислоты и меланина после обработки тканей фиксаторами на основе формалина или хлорида ртути.


8.6.1. Удаление пигмента

Основное требование, предъявляемое к методу удаления тканевых пигментов, состоит в том, что он не должен влиять на антигенные свойства ткани. Это сужает круг применимых методов, но некоторые пигменты все-таки удается удалить.


а. «Формалиновый» пигмент

В этом случае ткань обычно погружают в спиртовый раствор пикриновой кислоты на 10 мин, а затем промывают водой. Эту процедуру иногда проводят до иммуноокрашивания, хотя она может отрицательно сказаться на антигенных свойствах ткани. Удаление формалинового пигмента происходит и в процессе применения иммунопероксидазного метода блокирования эндогенной перок-сидазы, при этом никаких дополнительных операций не требуется.


б. «Ртутный» пигмент

Этот пигмент удаляют либо до иммуноокрашивания, либо во время иммунопероксидазного окрашивания перед контрастированием препаратов. Для этого их погружают на 5 мин в спиртовый раствор иода, а затем обесцвечивают 5% тиосульфатом натрия.


в. Меланин

Отложения меланина можно удалить погружением препаратов на 5 мин в 0,25% перманганат калия с последующим их обесцвечиванием 2% щавелевой кислотой [40,41]. Поскольку эта процедура может негативно повлиять на некоторые антигены, нужно проводить контрольное окрашивание ткани, заведомо позитивной по данному антигену. Кроме того, может ухудшаться сцепление срезов со стеклом, поэтому желательно использовать адгезивы.


8.6.2.   Альтернативный субстрат

Большинство пигментов имеют темно-коричневый цвет и их легко спутать, например, с ДАБ. Поэтому в системах с ПХ лучше использовать другие субстраты или альтернативные метки, например щелочную фосфатазу.


8.6.3.   Сравнение с отрицательным контролем

Пигменты выявляют на отрицательном контрольном срезе, полученном от того же блока ткани, что и анализируемые срезы. И хотя проведение такого контрольного эксперимента довольно трудоемко, оно позволяет различить пигмент и продукт иммуно-цитохимической реакции.


8.6.4.   Гистохимическое выявление пигмента

В некоторых случаях пигмент можно обнаружить с помощью гистохимического метода контрастного окрашивания пигмента.

На наш взгляд из всех перечисленных приемов наиболее приемлемо использование альтернативного субстрата.


8.7. Детергенты

Проницаемость тканей для антител повышается, если добавить в буферные растворы или в растворы, содержащие антитела, такие детергенты, как тритон-100 или твин-80 [42].


8.8. Срезы

Более качественное окрашивание наблюдается на тонких срезах, полученных от небольших, хорошо зафиксированных блоков.


8.9. Повторное наслаивание

Интенсивность окрашивания при использовании ПАП и ЩФАЩФ значительно повышается после повторной инкубации реагента-мостика с комплексом фермент—антитело. Было показано также [43], что качество окрашивания улучшается при повторном наслаивании первого антитела и повторной инкубации с ним препаратов после промывания их в буфере.


8.10. Комбинация методов

Помимо описанных выше физических методов, улучшающих качество окрашивания, для выявления одного антигена можно использовать разные системы иммуноокрашивания.



9. Двойное и тройное окрашивание

Два и более антигенов в одном мазке или срезе можно выявить несколькими способами.


9.1. Последовательное окрашивание

Срез или мазок окрашивают, чтобы выявить один из антигенов, и фотографируют. Затем до наслаивания второго антитела, связывающегося с другим антигеном, элюируют комплекс антиген-антитело или обесцвечивают субстрат с помощью перманганата калия.


9.2. Одновременное окрашивание

Наиболее эффективный вариант метода двойного окрашивания — выявление и визуализация двух и более антигенов одновременно. При этом используют два подхода:

а) наслаивают на препарат одно антитело и используют систему детекции, выявляющую соответствующую метку, а затем проводят аналогичные операции со вторым антигеном;

б) если используются антитела от разных видов, смешивают обе партии реагентов и проводят окрашивание в один прием.


При этом можно использовать

• две или три флуоресцентных метки, как правило, готовые конъюгаты антител [44];

• одну ферментную метку для выявления двух антигенов, каждый из которых визуализируют с помощью своего субстрата;

• две ферментные метки [45];

• комбинацию фермент—иммуноглобулины, меченные золотом, с усилением окраски серебром [46].

Важно, чтобы разные компоненты используемой системы не давали перекреста. Лучше всего, если антитела происходят от разных видов и компоненты двух систем иммуноокрашивания не реагируют между собой. Можно использовать и два первых антитела от одного и того же вида, но при этом следует иметь в виду, что на втором этапе реагент-мостик может связаться с любым первым антителом, не прореагировавшим на первом этапе, что даст ложноположительный результат.


Следует позаботиться и о выборе субстрата с тем, чтобы получить хороший контраст при окраске продуктов. В зависимости от исследуемых антигенов можно при необходимости разводить антитела так, чтобы окрашивание было сбалансированным, лишь бы одна реакция не маскировала другую.

Несмотря на то, что последовательное окрашивание требует больше времени, мы предпочитаем именно этот метод, используя две разные ферментные метки независимо от источника антител. При наличии адекватного контроля перекрестных реакций можно использовать первые антитела от одного вида.


10.Некоторые проблемы и способы их решения

В последнее время в иммуноцитохимии достигнуты значительные успехи. Улучшилось качество реактивов, а фирмы-производители стали давать подробные инструкции по их применению. Все это помогло решить некоторые проблемы, ранее возникавшие при проведении иммуноцитохимических анализов. Однако ряд проблем все-таки осталось, и связано это с

• плохой морфологией препаратов;

• плохим окрашиванием;

• наличием фонового окрашивания.

Эти проблемы суммированы в табл. 2.3.


10.1. Другие замечания


10.1.1. Фоновое окрашивание

При наличии интенсивного фона неизвестного происхождения нужно выяснить, на каком этапе он появился. В предположении, что дело не в плохой фиксации ткани или неправильном приготовлении препарата, причину можно установить методом исключений. Для этого готовят и окрашивают несколько срезов по следующей схеме.


№ препарата

1

2

3

4

5

6

7

8

Блокирующая сыворотка

+

0

+

+

+

+

0

+

Первое антитело

+

+

0

+

+

+

0

0

Второе антитело

+

+

+

0

+

+

0

0

Третий реагент

+

+

+

+

0

+

0

+

Субстрат

+

+

+

+

+

0

+

+


Несмотря на всю трудоемкость такого анализа, последователь­ное исключение компонентов обязательно приведет к установле­нию причины появления фона и позволит ее устранить.



Таблица 2.3. Проблемы, возникающие при проведении иммуноцитохимического анализа

А. Плохая морфология


Возможная причина

Устранение

Неправильная молярность буфера

Возьмите новый буфер.

Проверьте маточные растворы

Загрязнение буферов, препаратов антител и других реактивов микро­организмами

Замените новыми.

Проверьте маточные растворы

Неправильная фиксация, особенно замороженных срезов и мазков

Используйте свежий фиксатор и/или пересмотрите протокол

Излишний протеолиз

Пересмотрите операции. Проверьте правильность приготовления рас­творов и температуру инкубации

Подсыхание срезов во время окрашивания

Герметизируйте камеру

Плохие препараты клеток/тканей

Пересмотрите операции

Неоднократное замораживание и оттаивание тканей

Пересмотрите операции

Образование конденсата на замороженных срезах

Оставьте препараты в фольге, пока они не прогреются до комнатной температуры

Б. Слабое окрашивание или отсутствие окраски

Возможная причина

Устранение

Первые антитела не подходят для данных препаратов

Проверьте срок хранения антител, прочтите прилагаемую инструкцию

Неправильная фиксация

Проверьте срок хранения реактивов, прочтите инструкции.

Пересмотрите протокол

Присутствие ингибиторов в дистиллированной воде

Используйте стеклянные дистилляторы

Буферы содержат азиды

Азиды инактивируют ПХ

Грязное оборудование

Пользуйтесь чистым оборудованием

Неправильное хранение антител

Не храните антитела разведенными. Не замораживайте конъюгированные антитела или комплексы. Убедитесь, что емкости для хранения плотно закрываются. Лучше использовать емкости с крышкой на резьбе

В. Слишком сильное окрашивание и/или высокий фон

Возможная причина

Устранение

Присутствие эндогенного фермента

Убедитесь, что использована подходящая блокирующая процедура

Слишком велика концентрация антител

Уменьшите концентрацию

Перекрестная реакция 2-го и 3-го антител с иммуноглобулином человека

Абсорбируйте иммуноглобулин нормальной сывороткой, взятой у реактивного вида

Связывание эндогенного авидина

Используйте блокирующие процедуры

Слишком длительная инкубация с субстратом

Уменьшите время инкубации

Неправильно приготовленный субстрат

Проверьте способ приготовления

Неправильное промывание препаратов

Берите стекла по отдельности и

во время окрашивания

помещайте их в буфер не менее чем на 5 мин

Использована неподходящая

Используйте блокирующую сыворотку,

блокирующая сыворотка

полученную от того же вида, что и вторые антитела

Неправильная фиксация

Пересмотрите протокол

Низкая концентрация соли

Используйте NaCl в концентрации

в буфере для разведения антител

не менее 0,15М

Подсыхание срезов во время окрашивания

Герметизируйте камеру

Антитела попадают между срезами

Перед тем как поместить стекла в стакан для промывания, промойте их по отдельности. Убедитесь в правильном расположении препаратов во время инкубации



10.1.2. Отрицательный результат

Если оказывается, что антитела (в частности, моноклональные), выбранные для работы с препаратами фиксированной и заключенной в парафин ткани, на самом деле не дают желаемого результата, а все другие компоненты системы вполне эффективны, можно предположить следующую схему. Сначала нужно проверить, сохраняется ли данный антиген в условиях фиксации и обработки ткани. Следует обратить внимание на обработку протеолитическими ферментами. Если окраска по-прежнему неудовлетворительная, проверяют препарат антитела на срезах, фиксированных ацетоном, или на замороженных срезах. При отрицательном результате пробуют применить другую систему иммуномечения, проверяют условия хранения и срок годности антител, в конце концов обращаются на фирму, поставляющую препараты. Если результаты проверки антител на замороженных срезах положительные, то проверяют их на парафиновых срезах. В случае положительной реакции можно думать, что в исходном блоке ткани нет искомого антигена. Отрицательный результат при исследовании нового блока этой ткани указывает на неправильную фиксацию или обработку препаратов. В таком случае для выявления антигена необходимо изменить протокол. Когда метод отлажен, а положительный и отрицательный контроли дают ожидаемые результаты, но исход опыта отрицателен, можно предположить, что

• в ткани вообще нет антигена;

• содержание антигена настолько мало, что его нельзя обнаружить с помощью данного метода, а следовательно, нужно использовать более чувствительный метод;

• ткань перефиксирована или неправильно обработана и порезана. Это легко проверить, убедившись, что положительный контроль идентичен по своим характеристикам исследуемой ткани. В нашей лаборатории хранится серия блоков тканей (например, миндалин, кишечника), которые были фиксированы в течение разного времени в различных фиксаторах и могут использоваться как контроли в тех случаях, когда режим фиксации заведомо отличается от обычного.

Следует отметить, что большинство проблем, перечисленных в табл. 2.3, возникают по вине экспериментатора. Это подтверждает общее правило, что прежде чем использовать новый метод, нужно освоить все его этапы в полном соответствии с протоколом, а прежде чем применять новую партию антител или систему детекции, нужно ознакомиться с их характеристиками. Необходимо прочитать описание реактивов в прилагаемой инструкции, а также имеющие отношение к делу публикации. Если, судя по литературным данным, какие-то антитела используют только при работе с замороженными срезами, не стоит удивляться, что они не дают удовлетворительных результатов в случае фиксированных парафиновых срезов.





Литература

1. Huang W. М., Gibson S. ]., Facer Р., Gu J., Polak J. M. (1983). Histochemistry, 77, 27.

2. Maddox P.H., Jenkins D. (1987). J. Clin. Pathol., 40, 1256.

3. Mori S., Sawai T., Teshima T., Kyogoku M. (1988). J. Histochem. Cytochem., 36, 111.

4. Chaplin A. J., HeryetA., Holdsworth L. N„ Eglin R. P„ Millard P. R. (1989). J. Clin. Pathol., 42, 318.

5. Muramalo L. M., Kadin M. E. (1987). Am. J. Clin. Pathol., 88, 589.

6. Hall P. A., Steam P. M., ButlerM. G., D’ArdenneA. J. (1987). Histopathology, 11, 93.

7. Ceilings L. A., PoulterL. W, Janossy G. (1984). J. Immunol. Methods, 75, 227.

8. BrenesF., Harris S., PazM, O.A., Petrovic L. M., Scheuer P. J. (1986). J. Clin. Pathol., 39, 459.

9. Islam A., ArchimbaudE., Henderson E. S., Han T. (1988). J. Clin. Pathol., 41, 892.

10. Niehans G. A., Manivel J. C., Copland G. T., Scheithauer B. W, Wick M. R. (1988). Cancer, 62, 1113.

11. LeongA. S-Y., Daymen M. E., MiliosJ. (1985). J. Pathol., 146, 313.

12. Moran R. A., Nelson F., JagirdarJ., Paronetto F. (1988). Stain Technology, 63, 263.

13. Hales S. A., Gatter К. C., Heryet A., Mason D. Y. (1989). Leukaemia and Lymphoma,I, 59.

14. Brown D. C., HeryetA., Gatter К. C., Mason D. Y. (1989). Histopathology, 14, 621.

15. Mullink H., Henzen-Logmans S. C., Tadema T. M., MolJ. J., MeijerC. J.L. M. (1985).J. Histochem. Cytochem., 33, 1103.

16. Athanasou N. A., Quinn J., Heryet A., Woods C. G., McGee J. O’D. (1987). J. Clin. Pathol., 40, 874.

17. Stein H., Gatter K., Asbahr H., Mason D. Y (1985). Lab. Invest., 52, 676.

18. Casey T. T., CousarJ. B., Collins R.D. (1988). Am. J. Pathol., 131, 183.

19. Van GoorH., Harms G., Gerritis P. O., KroeseF. G. M., PoppemaA., GrondJ.(1988).J.Histochem. Cytochem.,36, 115.

20. Glezerov V, Dorsett В. (1989). Stain Technology, 64, 105.

21. Ojeda J. L., Ros M. A., Kardo J. M. (1989). Stain Technology, 64, 243.

22. Gatter К. C., Mason D. Y., Heyderman E., Isaacson P.G. (1987). Histophatology, 11,661.

23. Mason D. Y, Gatter К. C. (1987). J. Clin. Pathol., 40, 1042.

24. Battifora H. (1986). Lab. Invest., 55, 244.

25. Wan W-H., Fortuna M. B., Furmanski P. (1987). J. Immunol. Methods, 103, 121.

26. Rowden G., Fraser R. B. (1988). Stain Technology, 63, 49.

27. Wood G. S., Warnke R. (1981). J. Histochem. Cytochem., 29, 1196.

28. Van Den Oord J. J., Facchetti F., De Wolf-Peeters C., Desmet V. J. (1989). J. Histochem. Cytochem., 37, 551.

29. Galiyas F., Gores Т., MerchenthalerI. (1982). J. Histochem. Cytochem., 30, 183.

30. Hsu C-М., Soban E. (1982). J. Histochem. Cytochem., 30, 1079.

31. Green M. A., Sviland M., Malcolm A. J., Pearson A. D. J. (1989). J. Clin. Pathol., 42,875.

32. Holgate C. S., Jacson P., Cowen P. N., Bird С. C. (1983). J. Histochem. Cytochem., 31,938.

33. Holgate C. S., Jacson P., Pollard K., Lunny D., Bird С. C. (1986). J. Pathol., 149, 293.

34. Ellis I. O., Bell J., Bancroft J. D. (1989). J. Pathol., 159, 13.

35. Sinclair R. A., Bums J., Dunnill M. S. (1981). J. Clin. Pathol., 34, 859.

36. Graham A. K, Herrington C. S., McGee J. O’D. (1991). J. Clin. Pathol., 44, 96.

37. Stress W. P., Jones M., Mason D. Y. (1989). J. Clin. Pathol., 42, 106.

38. MaWhinney W. H. B., Watford A., Rae M. J. L., Lauder I. (1990). J. Clin. Pathol., 43, 591.

39. LeongA. S-Y., MiliosJ. (1986). J. Pathol., 148, 183.

40. Alexander R. A., HiscottP. S., Hart R. L., Grierson I. (1986). Med. Lab. Sci.,43,1217.

41. McGovern J., Crocker J. (1987). Am. J. Clin. Pathol., 88, 480.

42. Herbert D. C., Weaker F. J., Sheridan P. J. (1982). J. Histochem., 14, 161.

43. Linsenmayer T. F., Fitch J. M., Schmidt T. M. (1988). J. Histochem. Cytochem., 36, 10758.

44. Staines W. A., Meister B., Melander T., Nagy J., Hokfelt T. (1988). J. Histochem. Cytochem., 36, 145.

45. Wagner L., Worman С. P. (1988). Stain Technology, 63, 129.

46. Gillitzer R., BergerR., MollH. (1990). J. Histochem. Cytochem., 38, 307.


Яндекс.Метрика