Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Гель-электрофорез ДНК — Микроскопическая техника в биологии и медицине

Гель-электрофорез ДНК / Электрофорез в агарозном геле

Материалы
1. 10 х буфер трис-борат-ЭДТА (ТБЭ): 0,9 М основный трис, 0,9 М борная кислота, 20 мМ  ЭДТА. рН доводят до 8,1—8,2 сухой борной кислотой
2. Агароза (для электрофореза)
3. Бромистый этидий EtBr: 10 мг/мл в стерильной дистиллированной воде
4. 6х буфер для нанесения: 0,25% бромфеноловый синий, 40% (в/о) сахароза в 1х ТБЭ

10xTBE-буфер ПРОПИСЬ:
10x, pH ~8.3;(храниться при NT в чистой посуде)

Состав 1x 10x Молярность 1L 500ml 100ml
Tris base 89mM 0.89M 121.14g/M 107.8g 53.91g 10.78g
Boric acid 89mM 0.89M 61.83g/M 55.03g 27.51g 5.503g
EDTA, pH 8.0 2mM 20mM 500mM 40ml

43.84g

20ml

21.92g

4.0ml

4.38g

H2O mQ 863.3ml 431.65ml 86.33ml

10x сток вполне устойчиво хранится при NT, если его профильтровать через 0.4µm фильтр.

Для PAAG используется как 1х, для агарозных — как 0.5х.  Для агарозных гелей имеет смысл применять при работе с маленькими (< 200bp) фрагментами. Считается, что клонирование из ТВЕ гелей сложнее, чем из ТАЕ.

50xTAE-буфер ПРОПИСЬ
Трис-ацетатный буфер, 1x pH = 7.6:
Tris-acetate 40mM
EDTA 1mM
хранить основной сток при 4oC, рабочее количество (~100ml) при NT

 

100ml 150ml 200ml 250ml 1000ml
Tris-base 2M 121.1g/M 24.22g 36.33g 48.44g 60.55g 242.2g
EDTA 0.05M 372.3g/M 1.862g 2.792g 3.723g 4.654g 18.615g
Укс. к-та ~1.56M 17.4M ~8.96ml

~9.40g

~13.44ml

~14.10g

~17.92ml

~18.80g

~22.40ml

~23.50g

~89.61ml

~94g

H2O mQ ~73.30g ~109.95g ~146.60g ~183.25g ~733g

p(50x)=1.0878  удобно вначале растворить Tris и EDTA и лишь затем добавлять кислоту, следя за pH.

 

Методика

1. Готовят 1 х ТБЭ в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля.

2.Добавляют к 1 х ТБЭ агарозу в количестве, необходимом для получения 0,35—0,45% (в/о) раствора, и нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.

3. Охлаждают смесь до +/- 50 °С.

 

За время охлаждения агарозы, заклеивают края УФ — проницаемой кюветы для геля автоклавированной липкой лентой.

4.Добавляют к раствору агарозы бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивают, избегая появления в геле пузырьков воздуха.

 

 

5. Теплую агарозу выливают в кювету для геля и равномерно распределяют ее по кювете. Вертикально вставляют гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм.

 

6. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин, затем осторожно удаляют гребенку и липкую ленту. Кювету с гелем помещают в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество 1 х ТБЭ с бромистым этидием в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

7. Подготавливают к электрофорезу образцы исследуемой и маркерной ДНК, для чего смешивают их с буфером для нанесения (5:1, о/о). Чтобы получить четкий сигнал при окрашивании бромистым этидием-EtBr, в лунку шириной 5 мм достаточно внести 200 нг маркерной ДНК. Для построения стандартной кривой необходимо использовать маркерные фрагменты, длина которых примерно равна длине исследуемой ДНК.

(EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.)

8. Осторожно вносят в лунки исследуемую и маркерную ДНК. для повышения точности определения размера маркерную ДНК наносят по обе стороны от исследуемой.

9. Проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—3 В на 1 см геля в течение 1—3 ч.
10. Просматривают гель в УФ-свете на транс иллюминаторе и фотографируют .

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: