Извлечение куриных эмбрионов. Протокол

Куриные эмбрионы проще препарировать, так как они больше мышиных эмбрионов на аналогичной стадии развития. Так же как и мышиные эмбрионы, куриные эмбрионы используются для получения первичной культуры мезенхимальных клеток для исследовании клеточной пролиферации, для получения клеток для фидерного слоя и как субстрат для наращивания вируса. Из-за крупного размера у куриных эмбрионов легче изолировать индивидуальные органы для получения специфичных типов клеток, таких как гепатоциты, кардиомиоциты и легочный эпителий. Как и в случае с мышиными эмбрионами, эксперименты с куриными эмбрионами подпадают под действие закона об экспериментах на животных (например, в Великобритании), поэтому для работы с эмбрионами после половины срока беременности может потребоваться лицензия.

ПРОТОКОЛ 12.2. Извлечение куриных эмбрионов

Схема
Извлечь из яйца эмбрион в асептических условиях и поместить его в чашку.

Материалы
Стерильные:
• DBSS: BSS для препарирования (BSS с высокой концентрацией антибиотиков, смотри Приложение I) в пробирке с закручивающейся пробкой объемом 25-50 мл или в универсальном контейнере.
•50 мл BSS в стерильном стакане (используется для охлаждения инструментов после стерилизации пламенем).
•Маленький стакан 20-50 мл или поставка для яйца.
•Прямой и изогнутый пинцеты.
•Чашки Петри диаметром 9 см.

Нестерильные:
•Яйца с 10-дневными зародышами
•70% спирт.
•Тампоны
•Инкубатор с увлажненной атмосферой (без дополнительного CO2).

Протокол:
1.Инкубируйте яйца при 38,5 °С в увлажненной атмосфере; ежедневно переворачивайте яйца на 180°.

2.Хотя куриные яйца насиживают от 20 до 21 дня, продолжительность стадий развития эмбриона отличается от стадий развития мышиного эмбриона. Для получения культуры изолированных клеток из целого эмбриона яйцо необходимо инкубировать 8 дней, для выделения рудиментарных органов — около 10-13 дней.

3.Протрите яйцо 70%-м спиртом и поместите его тупым концом вверх в маленький стакан (рис. 12.4а).

4.Разбейте скорлупу в верхней части (рис. 12.4б) и снимите скорлупу над воздушным мешком стерильным пинцетом (рис. 12.4в).

5.Простерилизуйте пинцет (например, погружая его в спирт и далее прожигая спирт на пинцете, и охладив пинцет в стерильном BSS) и удалите белую скорлуповую оболочку, чтобы обнажить нижнюю хориоаллантоисную оболочку (ХАО) с кровеносными сосудами (рис. 12.4г, д).

6.Прорвите ХАО стерильным изогнутым пинцетом (рис. 12.4е) и вытащите эмбрион, осторожно придерживая его пинцетом ниже головы (рис. 12.4 ж, з). Не сжимайте пинцет слишком сильно, иначе порвется шея; поместите средний палец под пинцет и используйте подушечку, чтобы уменьшить давление указательного пальца (рис. 12.4ж). Перенесите эмбрион в чашку Петри диаметром 9 см с 20 мл DBSS (рис. 12.4м). (Дальнейшее препарирование и культивирование описано в протоколе 12.7.)

Рис. 12.4. Извлечение куриного эмбриона из яйца. Стадии извлечения целого куриного эмбриона из яйца.

(а) Протирание яйца спиртом.
(b) Разбивание скорлупы,
(c) Удаление скорлупы,
(d) Удаление скорлуповой оболочки.
(e) Обнажение хориоаллантоисной (ХАО) оболочки с кровеносными сосудами.
(f) Удаление ХАО пинцетом,
(g) Захватывание эмбриона вокруг шеи.
(h) Извлечение эмбриона из яйца,
(i) Изолированный 10-дневный эмбрион в чашке Петри

ПРОТОКОЛ 12.7. Рудиментарные органы куриного эмбриона

Схема
Извлечь отдельные органы и ткани и поместить их (желательно целиком) в холодный трипсин на ночь.

Удалить трипсин, кратковременно инкубировать органы или ткань и диспергировать их в культуральной среде. Развести и посеять в культуру.

Материалы
Стерильные:

•DBSS

•0,25% трипсин грубой очистки (Difco 1:250 или аналогичный) в среде RPMI 1640 или S-MEM на льду; при использовании трипсина более высокой степени очистки можно использовать более низкие концентрации, например 0,05-0,1% кристаллического трипсина производства Sigma или Worthington Grade IV
•Культуральная среда (например, DMEM/F12 с 10% FBS), минимальный объем — 12 мл на одну ткань
•Чашки Петри диаметром 9 см, не для культуры ткани
•Культуральные флаконы площадью 25 см2 (2 на 1ткань)
•Скальпели (лезвие № 11 для общих целей)
•Хирургический нож для иридэктомии для тонкого препарирования
•Изогнутый и прямой тонкие пинцеты
•Пипетки (пастеровские на 2 и 10 мл)
•Пробирки, желательно стеклянные, на 10-15 мл с закручивающимися крышками

Нестерильные:
•Куриные яйца с 10-13-дневными зародышами
•Ледяная баня
•Бинокулярная препаровальная лупа.

Протокол
1.Извлеките эмбрион из яйца, как описано ранее (см. протокол 12.2) и поместите его в стерильный DBSS.
2.Извлеките голову (рис. 12.11 а, б).
3.Извлеките глаз и аккуратно откройте его, удаляя хрусталик, внутриглазную жидкость и стекловидное тело (рис, 12.11в, г).
4. Захватите сетчатку двумя парами тонких пинцетов и осторожно отделите пигментированную сетчатку от нейрональной сетчатки и соединительной ткани (рис. 12.1 Id). (Для препарирования 10-дневного эмбриона необходима препаровальная лупа. Кратковременная инкубация в 0,25% трипсине в 1 мМ ЭДТА упростит разделение двух тканей.) Положите ткани с одного края чашки.
5.Проколите верхнюю часть головы кривым пинцетом и извлеките мозг (рис. 12. Не). Поместите мозг рядом с сетчаткой на край чашки.
6.Разделите туловище поперечно там, где розовая печень просвечивает через кожу живота (рис. 12.11 ж). Если сделать разрез по линии диафрагмы, то он пройдет между сердцем и печенью; но иногда печень может находиться не в нижней части, а в верхней части.
7.Аккуратно исследуйте изнутри разрезанную верхнюю часть туловища и извлеките сердце и легкие (рис. 12.11з; выделите органы, но не разрезайте их до идентификации). Отделите сердце от легких и поместите на край чашки.
8. Прозондируйте нижнюю половину и извлеките печень со скрученным кишечником, находящимся между долями печени (рис. 12.11м). Отделите печень от кишечника и поместите каждый на край чашки.
9. Отогните стенку тела в обратную сторону, чтобы раскрыть внутреннюю часть задней поверхности брюшной полости в нижней половине тела. Продолговатые, состоящие из долек, почки должны быть видны параллельно обеим сторонам срединной линии.
10.Осторожно подведите кончик скальпеля под каждую почку и извлеките почки из брюшной полости (рис. 12.11 и). (Для препарирования 10-дневного эмбриона потребуется препаровальная лупа.) Аккуратно вырежьте почки и поместите их с одной стороны.
11. Расположите концы скальпелей вместе на срединной линии нижней части и, продвигая концы вперед, друг за другом, выдавите спинной мозг так же, как вы выдавливаете зубную пасту из тюбика (рис. 12.11л). (Этот этап может быть трудновыполним при работе с 10-дневными эмбрионами.)
12.Поверните вверх заднюю часть туловища эмбриона и снимите кожу со спины и верхней части ног (рис. 12.11м). Соберите и поместите эту кожу с одной стороны.
13.Извлеките мышцу из каждого бедра и соберите эти мышцы вместе (рис. 12.11н).
14.Перенесите все эти ткани (и любые другие, которые вы может быть захотите) в отдельные пробирки с 0,25%-м трипсином и поместите пробирки на лед. Убедитесь, что препараты тканей полностью погружены в трипсин.
15.Оставьте пробирки при 4 °С на 6-18 ч.
16.Осторожно удалите трипсин из пробирок, не затрагивая ткань; наклоняя и поворачивая пробирку
17.Инкубируйте ткань в следах трипсина 15-20 мин при 37 °С.
18.Добавьте по 4 мл среды в каждый из флаконов площадью 25 см2 (2 на каждую ткань).
19.Добавьте по 2 мл среды в пробирки с тканями и остатками трипсина и пипетируйте для диссоциации ткани, осторожно набирая в пипетку и выливая.
20.Дайте осесть крупным кусочкам ткани.
21.Перенесите надосадочную жидкость с помощью пипетки в первый флакон перемешайте е и перенесите 1 мл разбавленной суспензии во второй флакон. В результате этой процедуры получится 2 флакона с различной концентрацией клеток, и это избавляет от необходимости считать клетки. Оптимальная концентрация клеток для использования в последующих экспериментах определяется опытным путем.
22.Смените среду, когда потребуется (например, для мозга может быть необходимо заменить
среду через 24 ч, а для пигментированной сетчатки — возможно через 5-7 дней) и проверьте специфическую морфологию ткани и функции.

 

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам:

Яндекс.Метрика