Культивирование фибробластов человека для исследования хромосом

Введение
Анализ кариотипа клеток кроветворной и соединительной ткани человека представляет собой весьма важную диагностическую процедуру при полном цитогенетическом исследовании больных, у которых по клиническим данным предполагаются хромосомные аномалии. В отличие от относительно простого способа получения 2—3-дневных культур лимфоцитов крови (наиболее широко используемый источник клеток для хромосомных исследований) культивирование фибробластов — более сложная процедура, включающая длительный период (несколько недель), в течение которого получают соответствующую клеточную популяцию, достаточную для проведения исследования. Длительное культивирование, трудности, связанные с ростом клеток в культуре, варьирующим у разных больных,— все это ограничивает применение метода культивирования фибробластов в целях диагностики.

Методы получения достаточного количества метафазных клеток человека делят на 3 группы (в зависимости от типа .исследуемых клеток). К первой относятся методы, не требующие больших затрат времени,— это кратковременное культивирование костного мозга из грудины или гребня подвздошной кости; препараты из этого материала можно приготовить менее чем через 24 ч, не применяя агенты, вызывающие митозы [1, 2]. Ко второй группе относятся методы, связанные с пролиферацией бластоподобных клеток из зрелых лимфоцитов крови, селезенки, лимфатических узлов и т. д. В этом случае для стимуляции митозов добавляют фитогемагглютинин [3]; опыт длится 48—72 ч. И наконец, третья группа методов связана с длительным культивированием фибробластов из плотных тканей, таких, как кожа, без применения агентов, индуцирующих митоз. Методы выращивания фибробластов или фибробластоподобных клеток в свою очередь подразделяются на 2 группы в зависимости от способа инициации первичной культуры: либо из клеточной суспензии, получаемой механически или трипсинизацией исходного материала [4], либо из кусочка ткани, предварительно заключенного в сгусток [5]. Ниже приведен метод получения метафазных пластинок из соединительной ткани человека; этим методом, основанным главным образом на ранее описанных методах [6, 7] с некоторыми модификациями, пользуются в лаборатории авторов.

Общие требования к лаборатории и аппаратуре

Как в любом случае длительного культивирования, успешное поддержание культуры фибробластов пересевами в течение нескольких недель или больше зависит от соблюдения правил асептики, что предотвращает попадание микроорганизмов в культуры. Работу с фибробластами можно проводить в помещении, используемом для других лабораторных работ, но при этом повышается вероятность заражения культур. Антибиотики, которые добавляют в основную ростовую среду, лишь частично обеспечивают защиту от случайно попадающих микроорганизмов. Для успешной работы с культурами фибробластов основным требованием является наличие отдельного помещения, стены которого и рабочая поверхность стола должны легко мыться. Необходим также простой бактериологический колпак. Важно помнить, что большая часть материала, получаемого для хромосомного анализа, невосполнима, поскольку не всегда возможно провести повторную операцию у больного. По этой причине для проведения предполагаемых цитогенетических исследований на фибробластах необходимо обеспечить отдельное удобное помещение.
Из лабораторного оборудования, которое требуется для культивирования фибробластов, необходимы термостат, водяная баня, инкубатор, холодильник, 2 специальных газовых баллона, инвертированный микроскоп и центрифуги.

Термостат
Весьма важно, чтобы в выбранном термостате поддерживалась постоянная температура, равная 37,4=0,5 °С, и чтобы эта температура сохранялась по всему объему термостата.

Водяная баня
Для нагревания среды и размораживания реактивов удобна стандартная водяная баня с внутренними размерами 13X10X6 см, в которой поддерживается постоянная температура.

Инкубатор
Эмбриональный экстракт получают из 10-дневных куриных эмбрионов, поэтому необходим небольшой инкубатор или брудер, в котором может одновременно помещаться 60 яиц. Уход за инкубатором сводится в основном к поддержанию нужной влажности, для чего следует лишь регулярно подливать воду в подносы.

Холодильник
Для хранения сред, реактивов и тканей может служить небольшой бытовой холодильник, имеющий камеру для замораживания.

Специальные газовые баллоны
При культивировании клеток 5%-ное содержание С02 в воздухе поддерживается с помощью калиброванного баллона с вентилем, обеспечивающим строго контролируемую подачу. Газ поступает преимущественно под бактериологический колпак на рабочем столе. Запасной баллон служит для заполнения основного баллона.

Инвертированный микроскоп
Для периодической проверки роста клеток в сосудах пользуются инвертированным микроскопом, который позволяет исследовать клеточный слой снизу, не переворачивая его. Сосуд с культурой помещают на подвижный столик, расположенный над револьверной головкой микроскопа с объективами; источник света и конденсор находятся над сосудом, позволяет исследовать клетки, растущие в различных сосудах: от узких флаконов Карреля до матрасов глубиной 77 мм.

Центрифуги
Два типа центрифуг, имеющих крестовину на 6 стаканов по 20 мл и на 4 стакана по 60 мл, вполне удовлетворят потребности лаборатории.

Подготовка стеклянной посуды
Вся стеклянная посуда, применяемая при культивировании фибробластов, требует специальной обработки, поэтому ее следует мыть отдельно от другой лабораторной посуды, особенно если возможно загрязнение силиконизирующими жидкостями или сильными детергентами. Жиры и токсические вещества на поверхности стекла препятствуют прикреплению фибробластов для образования монослоя. Плохо вымытая посуда — одна из основных причин слабой пролиферации фибробластов в первичной культуре или в последующих пересевах; поэтому крайне важно тщательно следить за чистотой сосудов, в которых выращивают фибробласты.

Необходимая стеклянная посуда
(возможны вариации по обстоятельствам)
Флаконы Карреля, 4500 мм.
Гексагональные «рожки» из Пирекса объемом 125 мл.
Плоские матрасы объемом 100 мл.
Универсальные узкогорлые контейнеры.
Маленькие бутылочки.
Конические центрифужные пробирки.
Чашки Петри диаметром 6 см.
Пастеровские пипетки.
Градуированные пипетки.

Мытье посуды
Растворы
Концентрированный раствор метасиликата натрия (360+40 г кальгона, растворенных в 4 л воды) 1 н. НСI.
Стандартный детергент.
Метод
Новую и использованную стеклянную посуду замачивают на ночь в растворе метасиликата натрия, разбавленном в 100 раз водой, промывают водопроводной водой и нейтрализуют 1 ч в 0,01 н. НСI. Обработанную посуду погружают в горячий детергент—10 мл на 5 л горячей водопроводной воды. На этой стадии внутреннюю поверхность сосудов очищают ершиком, а пипетки промывают горячим раствором детергента, пропуская детергент через пипетку несколько раз. Споласкивают 3 раза проточной горячей водопроводной водой, затем дистиллированной водой, которую меняют трижды, и окончательно ополаскивают деионизованной водой. Колпачки от бутылок, силиконовые резиновые прокладки и пробки обрабатывают сходным образом. После высушивания посуда стерилизуется.

Растворы и компоненты ростовых сред

Стерильные растворы
Раствор Олсвера
Цитрат натрия — 8 г.
Хлористый натрий — 4,2 г.
Глюкоза — 20,5 г.
10%-ный раствор лимонной кислоты — 8 мл.
Деионизованная вода — до 1 л.
Стерилизуют автоклавированием.
Разливают по 3 мл в универсальные контейнеры.

Сбалансированный солевой раствор Хэнкса
К готовому раствору добавляют 1,4%-ный раствор NaHCO3 (вес/объем), pH которого доведен до 7,0 с помощью СО2; индикатором служит феноловый красный.

Раствор трипсина
Трипсин (Difco 1:250) —1 г.
Раствор Хэнкса— 100 мл.
Стерилизуют фильтрацией. Сначала из фильтра удаляют примеси, пропуская через систему деионизованную воду. При употреблении 1 мл запасного раствора трипсина разбавляют в 20 мл раствора Хэнкса.

Раствор колхицина
Колхицин C22H25NO6—1 мг/мл.
Перед употреблением разбавить до концентрации 0,01 мг/мл раствором Хэнкса. Запасной раствор надо готовить раз в месяц, а разбавленный рабочий раствор приготавливают в день использования. Если запасной раствор предполагают хранить более недели, то его стерилизуют фильтрацией, однако небольшие количества, которые готовят еженедельно и хранят в холодильнике, можно не стерилизовать.

Человеческая плазма для получения плазменных сгустков 5 мл свежей цельной крови добавляют к 3 мл раствора Олсвера, осторожно перемешивают и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин (до тех пор, пока смесь плазма — антикоагулянт не станет прозрачной). Плазму, кроме нижнего слоя, отделяют и разливают по 1 мл в маленькие бутылочки. По возможности пользуются свежей плазмой, но удовлетворительные сгустки получаются при хранении ее до недели при 4°С.

Для инициации образования сгустка добавляют 0,15 мл 2%-ного хлористого кальция в деионизованной воде к 1 мл плазмы.

Компоненты ростовых сред
Основная среда для культивирования тканей
Среда 199, содержащая 200 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.


Куриный эмбриональный экстракт
Лучше готовить экстракт в лаборатории из десятидневных куриных эмбрионов, а не пользоваться поступающим в продажу. Простой и надежный метод приготовления предложен Полом [8]. Необходимо следить, чтобы поступающие оплодотворенные яйца были хорошего качества; из некоторых партий получается мутный экстракт, причем осадок не удаляется фильтрованием. При добавлении таких экстрактов в ростовую среду на поверхности стекла образуется пленка, которая неблагоприятно сказывается на прикреплении фибробластов. Куриный эмбриональный экстракт (по 20 мл) хранят при глубоком замораживании. Перед употреблением его размораживают и центрифугируют для удаления тонкого осадка, количество которого увеличивается при длительном хранении.

Куриный эмбриональный экстракт можно использовать в течение 6 мес., после приготовления, но наиболее удовлетворительные результаты получаются при хранении менее месяца.
 

Сыворотка
Сыворотку, полученную из крови одного донора с группой крови АВ, стерилизуют фильтрованием. Опалесцирующая сыворотка, содержащая макроскопические липидные частицы, непригодна. Токсичную сыворотку, повреждающую ядро и цитоплазму, а также вызывающую хромосомные изменения, употреблять не следует. Каждый новый источник сыворотки проверяется на культурах контрольных активно размножающихся фибробластов. Для того чтобы свести до минимума эффект токсической сыворотки, рекомендуют смешивать сыворотку от разных доноров. Однако даже смешанная сыворотка может все же существенно снижать рост фибробластов, если в ней содержится сыворотка, обладающая сильным токсическим действием. Контроль каждой партии сыворотки как от одного донора, так и от группы доноров представляет собой крайне важную меру предосторожности.

При отсутствии крови группы АВ можно пользоваться сыворотками, полученными из крови других групп системы АВО. Если нет человеческой сыворотки, можно временно брать телячью или свиную сыворотку, но скорость роста фибробластов при этом сильно уменьшается.

Ростовые среды для первичных и перевиваемых культур
Среда А
Используется для всех первичных культур.
Среда 199 с антибиотиками-12 мл.
Сыворотка крови группы АВ-4 мл.
Куриный эмбриональный экстракт-4 мл.

Среда Б
Используется для пересевов, которые необходимы для приготовления хромосомных препаратов.
Среда 199 с антибиотиками- 14 мл.
Сыворотка крови группы АВ -4 мл.
Куриный эмбриональный экстракт- 2мл.

Среда В
Основная поддерживающая среда, в которой хранятся запасные культуры и осуществляются контрольные пересевы.
Среда 199 с антибиотиками — 16 мл.
Сыворотка крови группы АВ — 4 мл.

Кожа и другие источники фибробластов
Кожа
Небольшой кусочек кожи, необходимый для получения культуры фибробластов, легко получить, не причиняя вреда больному, с внутренней поверхности предплечья (у взрослых) или с внутренней поверхности бедра (у детей). Некоторые исследователи предпочитают применять местную анестезию, например, 1%-ным прокаином [9], однако инъекций токсичного вещества вблизи источника клеток лучше избегать. Метод, предложенный Эдвардсом [10], относительно безболезнен в опытных руках, не оставляет постоянного шрама, и кровопотери при этом минимальны.
Выбранный участок кожи очищают 70%-ным спиртом. После того как спирт испарится, участок кожи 6— 8 мм длиной и 1—2 мм шириной зажимают заостренным стерильным пинцетом (длиной 11 см) с гладкими концами. Зажатая кожа должна возвышаться над краем пинцета на высоту 1 мм параллельно поверхности кожи бедра или предплечья. В таком положении кожу держат примерно 30 с до тех пор, пока она не станет белой и анемичной. Стерильным хирургическим лезвием проводят вдоль пинцета, и биопсийный материал помещают в маленькие бутылочки со средой 199. Появление небольшого количества крови после снятия пинцета указывает на то, что биопсия достаточно глубокая и захватила слой собственно кожи. Небольшая ранка заклеивается пластырем, который можно удалить через несколько дней.

Другие источники
Известно, что в случаях с аномалиями половых хромосом нередко прибегают к хирургическому вмешательству для идентификации первичных гонад. Взятый при этом материал первичных гонад, а также материал в какой-то мере дифференцированных яичников и семенников может служить источником фибробластов. Кусочки органов помещают в среду 199, причем необходимо избегать попадания в среду формалина или других фиксаторов, которые используются при фиксации биопсийного материала для гистологического исследования. Особенно широко распространенным источником фибробластов служит материал, полученный при пункционной биопсии, или кусочки тканей семенника, взятые при хирургическом вмешательстве, к которому часто прибегают в случае синдрома Клайнфельтера (XXY). Крошечный кусочек ткани — вот все, что требуется в этом случае для получения культуры фибробластов.
Источником фибробластов с успехом может служить материал, полученный при хирургических абортах. Этот материал особенно ценен при подозрении на аномалию плода главным образом потому, что определить характер хромосомного набора порой можно только по фибробластам. При самопроизвольных абортах материал, как правило, инфицирован, за исключением тех редких случаев, когда плодные оболочки оказываются целыми. Такой материал использовать не следует. Хорошим источником фибробластов служит кожа, взятая от мертворожденных плодов (немацерированных), трупов новорожденных, если после смерти прошло менее 24 ч и если трупы были заморожены. Биопсию, взятую от трупа, нужно поместить по крайней мере на один день в среду, содержащую антибиотики (среду необходимо несколько раз сменить), чтобы уменьшить возможность бактериального заражения.

Метод однослойных культур
Получение первичных культур
Фибробласты и фибробластоподобные клетки кожи и других тканей растут на поверхности сосуда для культивирования и образуют монослой, прочно прикрепленный к стеклу. Когда вся поверхность для роста зарастает клетками, фибробласты формируют многослойный пласт, который в конце концов отделяется от стекла в виде «шариков» из клетак. Пересевать клетки лучше тогда, когда они еще активно размножаются, т. е. до образования сплошного монослоя. Первичные культуры получают во флаконах Карреля диаметром 45 мм и глубиной 10 мм с узким горлом, плотно закрытым силиконовой резиновой пробкой. Главные преимущества сосудов этого типа для закладки культур фибробластов состоят в том, что: 1) сосуды обладают относительно большой площадью для роста клеток по сравнению с объемом культуральной среды; 2) небольшой объем воздуха над средой способствует поддержанию оптимального значения pH; 3) конструкция флаконов позволяет легко соблюдать асептические условия в течение долгого времени.
Фибробласты начинают делиться in vitro после некоторого «лаг-периода», длительность которого варьирует в зависимости от источника клеток. В течение этого «лаг-периода» клетки должны быть неподвижными и находиться в контакте с поверхностью флакона для того, чтобы приспособиться 1к искусственным условиям. Ниже мы приводим описание трех методов получения первич¬ных культур.

1. Метод прямого контакта
Первичный рост фибробластов можно получить непосредственно из кусочков быстро размножающихся тканей эмбрионов или новорожденных, которые помещают во флакон Карреля с таким количеством среды А, которое лишь ёдва покрывает дно флакона, и насыщают воздух 5% СО2. Флакон ставят в термостат на 48 ч, в течение которых его не рекомендуется сдвигать или трогать, после чего с помощью инвертированного микроскопа можно наблюдать за образованием выростов фибробластов. К этому времени кусочки прочно прикрепляются к стеклу и для образования монослоя общий объем среды увеличивают до 2 мл.
2. Метод трипсинизации
Суспензию одиночных клеток (получают обработкой трипсином измельченного кусочка кожи. Кусочек кожи полученный при биопсии, помещают в стерильную 6-сан-тиметровую чашку Петри со стерильным изотоничным 0,04%-ным раствором трипсина и стерильными инструментами разрезают на небольшие фрагменты. После инкубации при 37 °С в течение 30 мин при эпизодическом пипетировании жидкости с помощью пастеровской пинетки образуется густая суспензия клеток. Ее центрифугируют, осадок ресуспендируют в 1-2 мл среды А и помещают во флаконы Карреля, которые инкубируют при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% С02. Отдельные клетки и маленькие кусочки ткани, которые осели на стекло, должны начать делиться через несколько дней. Сходный метод описан Фраккаро и др. [11].
В нашей лаборатории нам редко удавалось получать успешные культуры с помощью этой методики. Фибробласты, не адаптированные к условиям in vitro, плохо садятся и прикрепляются к стеклу. На их прикрепление к стеклу влияют даже конвекционные токи в культуральной среде. Однако это затруднение можно преодолеть с помощью метода Хсю и Келлога [12] (разработанного на основе метода Эванса и Эрла [13]), предложивших использовать стерильные диски перфорированного целлофана для удержания клеточных агрегатов на месте до тех пор, пока клетки не начнут размножаться.
3. Метод заключения в сгусток плазмы
В сгустке плазмы эксплантаты (кожи прикрепляются к поверхности стекла и через некоторое время из них начинается рост клеток. Кусочек кожи, взятый при биопсии, помещают в стерильную 6-сантиметровую чашку Петри с небольшим количеством среды 199 и, пользуясь стерильными ножницами и пинцетом, разрезают на более мелкие кусочки размером от 0,5 до 1 мм. Черная материя или черная бумага под чашкой Петри способствует лучшему измельчению ткани. Если эти кусочки сразу поместить в сгусток плазмы, то в результате действия ферментов через несколько дней они могут открепиться от сгустка; «в таком случае их необходимо перенести в новый флакон Карреля. Протеолитического переваривания сгустка плазмы можно избежать, если биопсийные кусочки поместить во флакон Карреля с 2 мл среды А с 5% СO2 в воздухе и инкубировать их в течение 3-7 дней, прежде чем заключить в сгусток плазмы. Предварительная инкубация перед заключением кусочка в сгусток плазмы почти полностью устраняет опасность преждевременного открепления сгустка и не задерживает начала роста культуры.
Как правило, из одной биопсии получают две первичные культуры, в каждой из которых содержится примерно по 6 эксплантатов. Кусочки кожи по отдельности переносят в другую чашку Петри в небольшую каплю плазмы крови человека с антикоагулянтом и встряхивают, чтобы удалить остатки среды 199. Маленькие кусочки удобнее переносить из одного сосуда в другой с помощью пастеровской пипетки, имеющей небольшое сужение около кончика, которое препятствует попаданию кусочка в основную часть пипетки. С поверхности эксплантата удаляют большую часть плазмы и по возможности сухие кусочки переносят в два флакона Карреля. Затем к 1 мл плазмы человека добавляют 0,15 мл стерильного раствора 2%-ного СаС12 и тщательно перемешивают. Тонкой пастеровской пипеткой поверх каждого эксплантата наносят небольшую каплю этой смеси, затем ее отсасывают и заменяют свежей (кусочек ткани должен быть полностью покрыт плазмой, а не плавать на поверхности). Размер капли подбирается так, чтобы кусочек ткани мог прикрепиться к поверхности стекла в сгустке и вместе с тем чтобы капля не была слишком большой. Сгусток образуется примерно через 5 мин, хотя это время варьирует для разных доноров и зависит от срока взятия крови. Однако даже при небольшом опыте этого времени вполне достаточно для завершения операции. Флаконы Карреля, заткнутые ватными пробками, помещают в термостат по крайней мере на 30 мин для образования плотного сгустка, затем осторожно добавляют 2 мл среды А, а воздух насыщают 5% СO2. Ватную пробку заменяют резиновой.
Иногда из-за неточно выполненных процедур некоторые или даже все эксплантаты могут открепиться в течение нескольких часов. В таких случаях рекомендуется удалить открепившиеся кусочки, ополоснуть их в свежей плазме и снова заключить в плазму в новом флаконе Карреля.

Обработка монослоя для получения метафазных пластинок
Пересев клеток

После выхода фибробластов из эксплантата клетки начинают быстро размножаться. Примерно через 5—10 дней в зависимости от количества пролиферирующих эксплантатов при микроскопическом исследовании в культуре различим слой фибробластов, покрывающий около 2/3 всей поверхности дна флакона Карреля. На этой стадии клетки пересевают в большие по размерам флаконы Карреля.
Культуральную среду в исходном флаконе Карреля заменяют слабым изотоническим раствором трипсина. В результате мягкого воздействия трипсина фибробласты приобретают сферическую форму и открепляются от стекла. Примерно через 10 мин действия трипсина (при 37 °С) полученную суспензию клеток переносят в стерильную закрытую коническую пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок клеток ресуспендируют в 5 мл среды Б и переливают в сосуд для культивирования. Газовую фазу заменяют на смесь воздуха с 5% СО2, как и в случае первичной культуры, и клетки помещают в термостат при 37 °С. В течение 2-3 ч клетки оседают, прикрепляются к поверхности стекла и распластываются, а затем начинают размножаться. Ростовую среду обычно меняют 3 раза в неделю.
Наиболее удобны для культивирования детские «рожки» из стекла пирекс, закрытые резиновыми пробками. Количество метафаз, которое получают при обработке монослоя фибробластов на одной из плоских поверхностей такого рожка, достаточно для хромосомного анализа. После того как клетки первой субкультуры или первого пассажа сформируют монослой, их либо обрабатывают антимитотическим агентом для накопления метафаз и готовят (препараты хромосом, либо трипсинизируют и из суспензии клеток получают культуры второго пассажа в отношении 1:2 или более (рис. 7.1). Таким образом, если препараты хромосом окажутся неудовлетворительными, можно использовать клетки последующих пассажей для пересева и повторного анализа хромосом.
В исходных первичных трипсинизированных культурах в большинстве случаев вновь наблюдается рост фибробластов, если во флаконы Карреля добавить свежую культуральную среду и повторно инкубировать. Это может оказаться чрезвычайно важным в том случае, если не удалось получить успешной субкультуры.

Оптимальные условия для образования монослоя фибробластов
Метафазные пластинки для исследования хромосом можно получить лишь в том случае, если однослойную культуру зафиксировать в тот момент, когда часть клеток находится в митозе. Делящиеся фибробласты характеризуются измененной морфологией; из нормального вытянутого веретена они превращаются в сферические клетки, которые в растущих культурах легко распознаются под микроскопом. Используя этот признак, можно провести приблизительную оценку митотического индекса. Максимум митотической активности для первых субкультур наблюдается приблизительно через 18-24 ч после инокуляции при посеве не менее 5×10*5 клеток в 5 мл среды Б.
Можно увеличить митотическую активность, воздействуя на субкультуры холодовым шоком при температуре 4°С в течение 30-60 мин, что частично синхронизирует фазы клеточного цикла [14]. С этой целью в начале следующего дня после лосева клеток для кариологического анализа культуры помещают в холодильник при 4°С обычно на 30 мин. Затем их переносят в термостат при 37 °С и через 30 мин продолжают обработку. Если после трипсинизации клеток для посева прошло не более 24 ч, то нет необходимости применять холодовый шок, однако клетки, пересеянные раньше этого срока, не дают удовлетворительных результатов без воздействия Холодовым шоком. Как правило, максимальную активность получают в том случае, если холодовый шок применяют вскоре после пересева клеток.

Обработка колхицином
Метафазные пластинки, пригодные для анализа, можно получить и без использования колхицина. Однако выход метафаз намного увеличивается, если за 4-6 ч до конца культивирования в среду добавить колхицин, который останавливает делящиеся клетки в метафазе, так как подавляет образование веретена. Колхицин добавляют из расчета 0,2 мл раствора иа 5 мл среды (0,001 мг/мл в растворе Хэнкса) после холодового шока, когда культура согреется. Приблизительно через 5 ч культуры трипсинизируют и получают суспензию отдельных клеток. После центрифугирования раствор трипсина сливают и клетки осторожно ресуепендируют в теплом растворе Хэнкса.

Обработка клеток после добавления колхицина
Харнден [5] рекомендует пересевать клетки, непосредственно предназначенные для кариологического анализа, на покровные стекла, которые помещают в чашки Петри. Фибробласты, выросшие на покровных стеклах, обрабатывают in situ и получают препараты для изучения хромосом. Недостаток этого метода, кроме необходимости иметь некоторые навыки в обращении с хрупкими покровными стеклами, состоит еще и в том, что делящиеся сферические фибробласты легко открепляются от стекла и поэтому могут быть утеряны при фиксации. В митотических клетках, прикрепленных к стеклу, наблюдается плохой разброс хромосом, Фроланд [15] объединил метод Харндена [5] с техникой получения метафазных пластинок для исследования хромосом из венозной крови, описанной Мурхидом и др. [3]. Модифицированный метод Фроланда предполагает на последних стадиях обрабатывать клетки в суспензии. При этом всегда получается хороший разброс метафазных пластинок.
После обработки колхицином среду сливают в мерные конические пробирки и центрифугируют при 1000 об/мин для того, чтобы осадить открепившиеся клетки. Клетки монослоя дезагрегируют 0,05%-ным раствором трипсина при 37 °С. Полученную суспензию фибробластов соединяют с осадком клеток в центрифужной пробирке, осторожно пипетируют и вновь центрифугируют. Можно избежать небольших потерь клеток на стекле, если центрифужные пробирки и пипетки обработать силиконирующей жидкостью. Для получения хорошей однородной суспензии клеток нужно брать пипетку с узким концом, диаметр которого не превышает 1мм.

Обработка гипотоническим раствором
Цитоплазма клеток, хотя и не очень плотная, все же достаточно вязкая, чтобы препятствовать разбрасыванию хромосом при разрыве клеточной мембраны. Для того чтобы получить хороший разброс хромосом на метафазных пластинках, клетки обрабатывают гипотоническим раствором. Для этих целен используют 0,95%-ный цитрат натрия [15], 0,7%-ный цитрат натрия [9], 0,17%-ный раствор NaCl [16], 0,075 М КС1 [17] и различные разведения раствора Хэнкса. Все эти растворы дают удовлетворительный разброс хромосом в метафазе. Мы используем раствор Хэнкса, разведенный в 4 раза. После отмывания клеток раствором Хэнкса обычной концентрации большую часть надосадочной жидкости сливают; клетки оставляют в 0,5 мл раствора. Затем осторожно, по каплям, добавляют теплую дистиллированную воду до конечного объема 2 мл, так что концентрация раствора Хэнкса уменьшается в 4 раза. В этом разбавленном растворе клетки инкубируют при 37 °С в течение 15-20 мин.

Фиксация и получение разброса хромосом
Осадок клеток в конической пробирке, образовавшийся после центрифугирования гипотонического раствора, фиксируют в течение 30 мин смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), причем фиксирующую смесь лучше готовить непосредственно перед употреблением. После этого сливают надосадочную жидкость и клетки вновь суспендируют в свежем фиксаторе. На этой стадии с помощью силиконированной пипетки Пастера нужно хорошо «разбить» клеточные скопления, чтобы получить равномерную суспензию одиночных клеток. После центрифугирования клетки трижды промывают в свежеприготовленной смеси спирт—уксусная кислота если получается плохой разброс хромосом, то нужна дополнительная смена фиксатора), Наконец, клетки суспендируют в небольшом объеме фиксатора так, чтобы получилась не очень густая опалесцирующая суспензия молочно-белого цвета. Как правило, общий объем должен составлять 0,25-0,5 мл.

Разброс хромосом в делящихся клетках осуществляют с помощью модифицированного метода высушивания на воздухе, предложенного Ротфелсом и Симоновичем [18]. Обезжиренные спиртом чистые предметные стекла охлаждают в сосуде Коплина с дистиллированной водой, пока не начнется образование кристаллов льда. Стекло, вынутое из сосуда, покрыто ровной пленкой ледяной воды. На верхний конец стекла (стекло держат под углом 45°) наносят каплю клеточной суспензии, которая стекает вниз; слабое обдувание способствует более быстрому распределению клеток по поверхности. Интенсивно помахивая стеклом, препарат несколько подсушивают на воздухе, а затем полностью высушивают над пламенем спиртовки. Процесс высушивания должен быть быстрым и занимать не более 30 с. Высушенный препарат просматривают с помощью микроскопа, чтобы оценить степень разброса делящихся клеток. Приобретя некоторые навыки, можно получать хорошие результаты, Если не удается таким способом получить хороший разброс в метафазных пластинках, то предметное стекло «поджигают», как только капля клеточной суспензии в фиксаторе расползется по поверхности влажного охлажденного стекла; однако в результате такого грубого обращения возникают артефакты, в частности расщепление хроматид и утрата хромосом из-за их сильного разброса и разрыва клеточной мембраны. Поэтому в тех случаях, когда это возможно, желательно не применять технику «поджигания».
Препараты, приготовленные методом высушивания на воздухе, можно долгое время хранить либо до окрашивания, либо после окрашивания и заключения. Это явное преимущество описанного здесь метода, поскольку с помощью ранее применявшейся методики давленых препаратов гораздо труднее было получить постоянные препараты. Требовался большой практический опыт, чтобы достичь результатов, сравнимых с результатами, получаемыми при использовании техники высушивания на воздухе.
Предметные стекла с клетками сохраняют в метиловом спирте. Такая дополнительная фиксация (в отсутствие уксусной кислоты) способствует лучшему окрашиванию.

Окрашивание хромосом в метафазных пластинках фибробластов
Для окрашивания хромосом фибробластов в основном применяются те же методы, которые используются для окрашивания хромосом лейкоцитов человека: реакция Фёльгена, различные варианты окрашивания ацето-орсеином и методика Романовского, Для общего анализа хромосом лучше применять методику окрашивания Романовского, которая дает наиболее интенсивную окраску хромосом — от пурпурной до темно-фиолетовой. Препараты, окрашенные по Романовскому, Фёльгену или ацето-орсеином, просветляют в высококачественном не содержащем серу ксилоле и хранят в темноте, поскольку на свету они выцветают. Ниже приводится вариант окрашивания раствором Май-Грюнвальд-Гимза. Эта методика проста и дает надежные результаты при окрашивании препаратов, изготовленных методом высушивания на воздухе.

Реактивы
0.1.М  фосфатный буфер Серенсена, pH 6,8, разбавляют водой в отношении 1 :20.
Раствор Май-Грюнвальд -0,3 г порошка постепенно растворяют в 100 мл метилового спирта при 37°С в водяной бане, затем фильтруют. При использовании краситель разбавляют буфером в отношении 2 : 3.
Усовершенствованный Гарром раствор Гимза. При использовании к I ч. красителя добавляют 4 ч. буфера pH 6,8.

Метод
1. Предметные стекла с клетками .промывают в све-жем метиловом спирте.
2. Окрашивают разведенным свежим раствором Май- Грюнвальд в течение 3—5 мин.
3. Удаляют красящий раствор Май-Грюнвальд и заменяют его разбавленным раствором Гимза на 20 мин.
4. Быстро промывают водопроводной водой.
5. Дифференцируют в буфере до тех пор, пока цито-плазма не станет бесцветной. В большинстве случаев для этого препарат достаточно ополоснуть в буфере.
6. Осторожно промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.
7. Просветляют в двух сменах ксилола и заключают.
8. Хранят готовые препараты в темноте.

Анализ и фотографирование хромосом
Анализ метафазных пластинок фибробластов сходен с анализом метафаз трансформированных лимфоцитов из культур лейкоцитов крови. Хромосомы метафазных пластинок фибробластов на препаратах, приготовленных описанным выше способом, как правило, менее конденсированы, чем на препаратах культивированных лейкоцитов. Они тоньше и бледнее окрашены, но на них лучше различимы детали строения хромосомы в области вторичных перетяжек, например сателлиты хромосом групп D и G. Индивидуальные хромосомы классифицируют п идентифицируют по стандартной системе, рекомендованной Денверской исследовательской группой (1960) [19] п на Лондонской конференции (1963) [20]. Стандартная номенклатура, выработанная на конференции в Чикаго (1966) [21], может быть использована для описания численных и структурных изменений в хромосомном наборе человека.
Необходимыми помощниками при анализе хромосом являются микрофотографии.

Цитируемая литература
1. Ford. С. Е„ Jacobs P. A., Lajtha L. G., Nature, Lond., 181, 1565 (1958).
2. Tjio J. H., 'Whang J., Stain Technol., 37, 17 (1962).
3. Moorhead P. S.. Nowell P. C., Mettman W. Batiips D. М., Hun- gerford D. A., Expl Cell Res., 20, 613 (1960).
4. Puck Т. T„ Cieciura S. J., Robinson A., J. exp. Med., 108, 945 (1958).
5. Harnden D. G., Br. J. exp. Path. 41, 31 (1960).
6. Hyman J. М., J. med. Lab. Technol., 25, 81 (1968).
7. Poulding R. H., Progress in Medical Laboratory Technique, vol. 4, Butterworth. London, 1968.
8. Paul J., Cell and Tissue Culture, 2nd edn, Livingstone, Edinbourgh, 1960
9. Hirschkorn K., Cooper H., Am. J. Med., 31, 442 (1961).
10. Edwards J. H., Lancet, i, 496 (1960).
11. Fraccaro М., Kaijser K-. Lindsten I., Ann. hum, Genet., 24, 45 (1960).
12. Hsu Т. C., Kellogg D. S.. J. natn Cancer Inst., 25, 221 (1960).
13. Evans V. J., Earle W. R., J. natn Cancer Inst., 8, 103 (1947).
14. Sinclair W. K„ Morion R. A., Nature, Lond., 199, 1158 (1963).
15. Froland A., Acta path, microbiol, scand., 53, 319 (1961).
16. Tjio J. H„ Puck T. T„ J. exp. Med., 108, 259 (1958).
17. Hungerford D. A., Stain Technol., 40, 333 (1965).
18. Rotfqels К. H., Siminovitch L., Stain Technol., 33, 73 (1958).
19. Denver Study Group (1960), Lancet, i, 1063 (I960).
20. London Conference (1963), Cytogenetics, 2, 264 (1963).
21. Chicago Conference (1966), Birth defects: Original article series, II,2, The National Foundation, New York, 1966.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам:

Яндекс.Метрика