Культивирование макрофагов млекопитающих
Дж. УОСЛИ и Р. ДЖОН
St. Thomas’s Hospital Medical School, London
Введение
В этой главе очень подробно описано несколько испытанных методов культивирования макрофагов млекопитающих, так что она может послужить методической основой для тех, кто захочет заняться исследованием этих клеток в культуре. Важно уяснить с самого начала, что в данном случае культивирование означает лишь поддержание жизнеспособности, поскольку известно, что нормальные дифференцированные макрофаги млекопитающих, как правило, in vitro не размножаются.

Общая характеристика макрофагов
Прежде чем перейти к описанию методик, связанных с культивированием макрофагов млекопитающих, дадим краткую характеристику этих весьма своеобразных клеток, широко распространенных в животных тканях. Макрофаги обладают способностью к амебоидному движению; правда, эта их функция проявляется не всегда. Они способны заглатывать и переваривать с помощью внутриклеточных ферментов различные частицы и растворенные вещества — как эндогенные, так и чужеродные. Будучи производными мезенхимы, макрофаги относятся к лимфоидному ряду, и благодаря своей способности фагоцитировать частицы, которые иногда бывают антигенными, они наряду с лимфоцитами и плазматическими клетками играют важную роль в образовании антител.

Термин «макрофаг» был введен И. Мечниковым [1], который первым оценил значение фагоцитоза для защиты многоклеточных животных от патогенных микроорганизмов. Он предложил данный термин, чтобы отличать эти клетки высших животных от способных к амебоидному движению фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов крови, которые он назвал микрофагами.

Клетки, напоминающие макрофаги высших животных, встречаются у разных представителей животного царства, даже у самых примитивных многоклеточных. У низших организмов, у которых нет циркуляторной системы или у которых в циркулирующей жидкости отсутствуют клетки типа микрофагов, макрофаги находятся в соединительной ткани. Они свободно «блуждают» по межклеточным пространствам, соприкасаясь с поврежденными компонентами собственных тканей, а также с чужеродными частицами, включая паразитирующие микроорганизмы. Осуществляя свою функцию, макрофаги достигают соответствующих объектов благодаря хемотаксису и очень часто, особенно при микробном заражении, проявляют способность к быстрому размножению.

Способные к амебоидному движению фагоциты закрепились в процессе эволюции и сохранили большинство своих древних функций. Однако в результате прогрессивного развития различных органов многие макрофаги оказались «встроенными» в структуру органов и (за исключением особых случаев) осуществляют свою функцию там, где они оказались; это так называемые фиксированные макрофаги кровеносных и лимфатических синусоидов.

Макрофаги соединительной ткани
У высших животных и у человека, так же как и у низших животных, макрофаги присутствуют в рыхлой соединительной ткани. Они рассеяны по этой ткани в значительном числе без какой-либо определенной закономерности. Их особенно много в адвентиции кровеносных сосудов, где находятся также различные клетки, являющиеся их предшественниками; они встречаются в субсерозной ткани — под брюшиной и плеврой.

В нормальных условиях макрофаги соединительной ткани не активны и известны как «блуждающие клетки в покое» или адвентициальные клетки. Форма таких покоящихся клеток зависит главным образом от давления со стороны окружающей ткани. В более плотных тканях они плоские, их цитоплазма образует несколько коротких и тупых, а иногда тонких, длинных и ветвистых отростков; в более рыхлой ткани они округлые с меньшим числом цитоплазматических отростков. При стимуляции, например на некоторых стадиях воспалительного процесса, макрофаги соответствующего участка втягивают цитоплазматические отростки, приобретают амебоидную подвижность, становятся активно фагоцитирующими и могут увеличиваться количественно, по крайней мере частично, за счет размножения и дифференцировки соседних клеток-предшественников. В таком активном состоянии (в этот период их обычно относят к гистиоцитам [2]) их иногда накапливается очень много, и они тесно прилежат друг к другу, напоминая эпителий; в этом случае их называют эпителиоидными клетками. При определенных воспалительных реакциях, например при туберкулезе или при попадании в ткани крупных чужеродных частиц, несколько макрофагов могут сливаться друг с другом с образованием многоядерных или гигантских клеток. Ранвье [3] заметил, что от активных макрофагов иногда отшнуровываются фрагменты цитоплазмы, и поэтому он назвал их клазматоцитами— термин, который сейчас почти не используется. Этот процесс, названный клазмацитозом, можно наблюдать в камере на ухе кролика, а также в культуре макрофагов, однако значение клазмацитоза до сих пор остается не ясным.
У высших животных рыхлая соединительная ткань — не единственный источник подвижных макрофагов. Часть макрофагов возникает из клеток-предшественников в костном мозге, селезенке и, возможно, в лимфатических узлах и попадает в кровяное русло, где они известны как моноциты, или большие одноядерные лейкоциты, на долю которых у человека приходится около 5% всех белых клеток крови. При многих воспалительных реакциях эти циркулирующие макрофаги мигрируют через стенки мелких сосудов в область воспаления и попадают в соединительную ткань. За этот счет увеличивается общее число макрофагов в ткани. Они активируют «местные» макрофаги, от которых не отличаются ни морфологически, ни функционально.
Макрофаги широко распространены в тканях центральной нервной системы, куда они попадают в процессе эмбриогенеза [4] и где, находясь в состоянии покоя, входят в состав микроглии. Макрофаги и их предшественники присутствуют также в соединительной ткани легких. Отсюда они постоянно мигрируют в альвеолы и выполняют там важную функцию удаления вдыхаемых с воздухом мелких частиц, в том числе и бактерий. Эти клетки фагоцитируют также различные эндогенные вещества, которые попадают в альвеолы в условиях патологии, например эритроциты при застойных явлениях в малом кругу в связи с сердечной недостаточностью. Эти клетки, известные как альвеолярные фагоциты, называются также пылевыми клетками и клетками сердечных пороков. Подобным же образом осуществляется защита других поверхностей организма, которые подвержены загрязнению, например слизистой глотки и кишечного тракта; эту функцию выполняют макрофаги рыхлой субэпителиальной соединительной ткани.

Макрофаги кровеносных и лимфатических синусоидой
Для макрофагов, функционирующих в рассмотренных выше тканях, характерно амебоидное движение: клетки мигрируют туда, где возникает необходимость в их фагоцитарной активности. Иначе функционируют фиксированные макрофаги: различные вещества приносятся к ним с током крови или лимфы. Как уже бегло упоминалось, эти клетки служат структурными компонентами специализированных лимфатических и кровеносных сосудов — синусоидов. Кровеносные синусоиды— это сосуды, которые выстланы не эндотелием, а фиксированными макрофагами. Они образуют густую сеть, которая непосредственно контактирует с клетками в определенных органах: в кроветворной ткани костного мозга, в красной пульпе селезенки, паренхиме печени (макрофаги здесь называют купферовскими клетками в честь описавшего их автора [5]), в коре и мозговом веществе надпочечников, в передней доле гипофиза, паращитовидной железе и копчиковом тельце. Эти специализированные сосуды соответствуют кровеносным капиллярам других тканей тела. Лимфатические синусоиды представляют собой пути, по которым проходит большая часть лимфы, направляющаяся в лимфатические узлы. Они несколько больше, чем щели в ткани лимфатических узлов, где имеется крупноячеистая ретикулярная сеть, к волокнам которой прикрепляются макрофаги.

Система макрофагов и ее функция
На основе применения главным образом прижизненных красителей принято считать, что все макрофаги, мигрирующие и фиксированные, сходны. Исследования, которые привели к этому заключению, обобщены в обзоре Ашофа [6] в 1924 г. С тех пор много было сделано для понимания взаимоотношений макрофагов с другими клетками кроветворных и лимфоидных тканей. Интерес к микроморфологии уступил место изучению функциональных особенностей макрофагов. В настоящее время интенсивно исследуется роль этой системы в инфекционном процессе, в образовании антител, метаболизме пигментов крови, в нарушениях липидного обмена, в метаболизме химиотерапевтических препаратов, биохимические и биофизические свойства, а также гиперпластические и неопластические потенции этих клеток. Большая часть этих исследований обобщена в обзорах Капелла [7, 8], Дауни [9], Жакоби [10] и в монографии Нельсона[11].

Макрофаги в культуре
Метод искусственного культивирования играет важную роль в исследованиях активности и функции макрофагов. Первоначально кусочки эксплантатов, содержащие макрофаги, культивировали на естественных средах главным образом в плазме. При таком способе культивирования плазма быстро свертывается, и клетки оказываются в петлях сети, что несколько затрудняет их изучение. Нити фибрина сдавливают клетки точно так же, как in vivo окружающие ткани сдавливают блуждающие клетки в покое; в результате морфология таких клеток весьма изменчива. Часть клеток эксплантата через некоторое время мигрирует из сгустка на прилежащую стеклянную поверхность сосуда. Наблюдать за такими клетками значительно легче, так как они свободны от фибрина и лежат в одной плоскости. Кроме того, в таком положении их форма не зависит от воздействия нитей фибрина. Однако миграция клеток требует времени, что служит лимитирующим фактором при работе с макрофагами млекопитающих, которые, не размножаясь, имеют ограниченную продолжительность жизни в культуре. Эта трудность преодолевается применением метода однослойных культур, основанного на приготовлении суспензии такой низкой концентрации, что на дне сосуда образуется один слой клеток. Этот метод дает возможность исследовать отдельные клетки и взаимоотношения между ними в нормальных и измененных экспериментальных условиях.

Независимо от источника клеток живые макрофаги в неактивном состоянии, суспендированные в жидкой питательной среде, имеют форму шара (подобно моноцитам циркулирующей крови) диаметром 15—25 мкм. С помощью фазово-контрастного микроскопа можно видеть, что ядро содержит одно ядрышко, обычно овальное или почковидное, и довольно рыхлую сеть хроматина. Хроматин бывает иногда более компактным, и тогда ядро соответственно меньше и обычно более округлое. Ядро расположено в клетке эксцентрично. Если оно почковидное, то выемка обращена в сторону дальней стенки клетки. В цитоплазме видны небольшие вакуоли, аморфные гранулы и центросома; последняя представляет собой расположенное около ядра крупное тельце, которое непрерывно совершает колебательные движения. Если ядро почковидное, то центросома лежит в участке цитоплазмы, прилежащем к выемке.

На хорошо фиксированных и окрашенных препаратах цитоплазма несколько базофильна. На них видно, что центросома содержит две отдельные центриоли и окружена аппаратом Гольджи, около которого расположена большая часть митохондрий. Электронная микроскопия выявляет в цитоплазме многочисленные лизосомы, которые, как известно, содержат различные гидролазы — кислую фосфатазу, катепсин, дезоксирибонуклеазу, рибонуклеазу, различные эстеразы, а также липазу.

Макрофаги  человека, кошки, мыши, кролика, крысы и других млекопитающих очень легко отличить от всех других клеток, если воспользоваться методом импрегнации серебром [12, 13]. Применение этого метода при выращивании клеток на «летающих» покровных стеклах весьма полезно для точного распознавания макрофагов в культурах, содержащих другие типы клеток (обзор соответствующей литературы и подробное описание методов можно найти в работе Маршалла [14]).

После того как живые макрофаги, суспендированные в жидкой питательной среде, прикрепляются к стеклянной поверхности сосуда, они постепенно утрачивают сферическую форму, становятся более или менее уплощенными, «выпускают» многочисленные короткие отростки, напоминая при этом блуждающие клетки в покое. Прикрепление к стеклу происходит через 2—3 ч после посева. Сила их адгезии удивительно велика (вероятно, она больше, чем у всех других клеток в аналогичных условиях). Такие культуры можно тщательно промывать, вовсе не рискуя смыть клетки. Процесс прикрепления клеток происходит особенно быстро при температуре тела и подавляется охлаждением. Если клетки прикрепляются к поверхности, несмачиваемой водой (например, большинство пластиков), то для этого требуется в 6 раз больше времени.

У прикрепившихся клеток выявляется характерная для макрофагов структура — «ундулирующая мембрана», описанная Каррелем [15]. Эта структура, которая хорошо различима в фазово-контрастном микроскопе, представляет собой узкий, совершенно прозрачный и сильно истонченный наружный край цитоплазмы уплощенной клетки; образуя складки наподобие волана, край этот находится в непрерывном ундулирующем движении. Когда клетка не движется, в разных участках края  вновь и вновь образуются и втягиваются многочисленные псевдоподии. Каждый из этих образующихся прозрачных выростов ограничен на конце ундулирующей мембраной. При амебоидном движении в направлении движения выбрасывается одна длинная псевдоподия, затем вся клетка вытягивается; ундулирующая мембрана окаймляет лишь передний край псевдоподии.

В однослойных культурах форма клеток варьирует в зависимости от расстояния между ними, а также от возраста культуры. В молодых культурах в отсутствие «перенаселения» и стимула к миграции клетки находятся в состоянии покоя или случайного движения. Находясь в покое, клетки вытягивают несколько псевдоподий, причем некоторые из них очень длинные и тонкие; на конце всех псевдоподий имеется ундулирующая мембрана. Иногда отдельные длинные псевдоподии могут подвергаться клазмацитозу. Если плотность клеток высока и они соприкасаются друг с другом, то, образуя многочисленные короткие отростки, клетки остаются неподвижными, хотя складчатый край псевдоподий продолжает совершать постоянные движения. В этих условиях клетки имеют тенденцию прилипать друг к другу, причем настолько крепко, что их удается снять со стенки сосуда в виде сплошного «эпителиоидного» пласта. Такое прочное соединение, вероятно, обусловлено переплетением псевдоподий соприкасающихся клеток; in vivo подобная картина характерна для макрофагов, выстилающих кровеносные синусоиды. В старых «перенаселенных» культурах некоторые эпителиоидные клетки могут сливаться друг с другом, образуя гигантские клетки.

При амебоидном движении макрофага, направленном в сторону фагоцитируемой частицы, вытягивается одна большая псевдоподия, как и при случайном движении, но, кроме того, вся мембрана выбрасывает многочисленные постоянно меняющиеся отростки. После приближения клетки частицы оказываются между двумя короткими псевдоподиями и как бы погружаются в цитоплазму клетки, находясь в вакуоле, где происходит ее переваривание. Частица, не поддающаяся перевариванию, сохраняется в клетке неопределенно долго. Если поглощается много вещества, то либо оно, либо продукты его расщепления накапливаются в клетке, в результате чего последняя сильно увеличивается. Механизмы фагоцитоза и переваривания у макрофагов подробно исследованы с помощью электронного микроскопа; соответствующее описание можно найти в монографиях по структуре клеток, например у Тонера и Карра [16].

Источники получения макрофагов для культивирования
Из сказанного ясно, что источником макрофагов могут служить многие ткани животных. Действительно, эти клетки всегда можно обнаружить на ранних этапах культивирования кусочков разных тканей, взятых у разных животных. В чистой культуре их впервые выделили в 1921 г. Каррел и Эбелинг [17] путем эксплуатации рыхлого поверхностного слоя (buffy coat) осадка, полученного при центрифугировании крови курицы. В качестве питательной среды авторы использовали гомологичную плазму, содержащую экстракт тканей эмбриона. Это удалось не только благодаря тщательности эксперимента, но и потому, что крупные одноядерные лейкоциты (макрофаги) крови птиц в отличие от других типов птичьих лейкоцитов способны к размножению и длительному существованию в искусственной среде. Это дало возможность в результате последовательных пересевов освободить культуру от примеси других клеток. Каррел и Эбелинг поддерживали культуру макрофагов в хорошем состоянии в течение 3 мес. Они исследовали их морфологию, способность к амебоидному движению и фагоцитозу, а также их реакции на изменения состава культуральной среды.

Поскольку многие работы, выполненные на макрофагах, имеют отношение к проблемам физиологии и патологии человека, желательно проводить такие исследования на культурах макрофагов человека или по крайней мере на макрофагах млекопитающих. Попытки выполнить это требование  сразу же наталкиваются на трудности, связанные с тем, что, хотя макрофаги млекопитающих сохраняют жизнеспособность в искусственной среде, заставить их размножаться в этих условиях до сих пор не удавалось (имеется 1-2) сомнительных исключения). Вероятно, это обусловлено не методикой культивирования, а тем, что и in vivo нормальные дифференцированные макрофаги не способны к размножению. Какова бы ни была истинная причина этого явления, оно стимулировало поиски таких источников макрофагов, из которых можно было бы получить достаточно макрофагов при минимальном числе клеток других типов без риска загрязнения культуры микроорганизмами.

Оказалось, что среди доступных для анализа наиболее пригодны клетки следующих млекопитающих (расположены в порядке убывания): мыши, кролика, человека, морской свинки, крысы. Найти ткань, практически пригодную в качестве источника макрофагов, не так легко. В ряде тканей содержится мало макрофагов — достаточно серьезный недостаток, поскольку в культуре эти клетки не размножаются. В материале из некоторых тканей неизбежна примесь других клеток; порой это не столь важно, иногда же для освобождения от этих клеток приходится прибегать к весьма сложным приемам. Ткань иногда так неудачно расположена, что для получения «чистого» материала, свободного от микроорганизмов, приходится изыскивать особые методы.

Для иллюстрации сказанного рассмотрим кратко те «за» и «против», которые приходится учитывать при выборе того или иного из используемых обычно источников, включая те, которые обеспечивают приемлемый компромисс и которые подробно описаны ниже.

Доступным источником макрофагов может служить цельная кровь. Ее легко взять с соблюдением правил асептики, однако методика отделения макрофагов (моноцитов) от других клеток сложна и выход макрофагов довольно мал. Много макрофагов содержится в кроветворной ткани костного мозга, однако, как и при использовании в качестве источника других солидных тканей, получить из ткани костного мозга однослойную культуру клеток можно лишь за счет миграции их из эксплантатов; поэтому в таких культурах неизбежна примесь фибробластов, которые, размножаясь, постепенно вытесняют макрофаги.

Перитонеальные транссудаты большинства млекопитающих содержат макрофаги. Особенно много этих клеток в транссудатах у мыши и морской свинки, однако наряду с макрофагами там присутствуют самые разнообразные их предшественники, а также лимфоциты, эозинофильные полиморфноядерные лейкоциты и тучные клетки. Перитонеальный транссудат — это наиболее широко используемый источник макрофагов, поскольку его можно получить путем вымывания, соблюдая асептические условия, а от примеси посторонних клеток легко освободиться. Между мышами и морскими свинками в этом отношении нет различий, но, так как мыши дешевле, обычно пользуются ими.

В качестве практической рекомендации для увеличения содержания макрофагов в перитонеальной жидкости можно предложить внутрибрюшинную инъекцию чужеродных веществ обычно за несколько дней до вымывания жидкости. Используются разные вещества: при работе на мышах —крахмал [18], казеинат натрия [19] и тиогликолатная среда Difco[20]; в опытах на морских свинках гликоген [21]. Подобное воздействие применяется и на других животных, например на кроликах— гликоген [22], легкое или тяжелое минеральное масло [23, 24] и жидкий парафин [25]; на крысах — гликоген печени кролика [26], бульон из бычьего сердца с добавлением протеозного пептона Difco [23] и протеозный пептон [27]. Подобное воздействие значительно увеличивает выход макрофагов, особенно при использовании тех животных, у которых в норме перитонеальный транссудат не очень богат этими клетками. Не известно, однако, будут ли макрофаги, полученные после такого воздействия in vivo, нормально реагировать на разнообразные агенты в культуре. Кроме того, существует приводимый ниже метод получения высокого выхода перитонеальных макрофагов мышей и без применения дополнительных воздействий.

Хорошим источником макрофагов может служить жидкость, взятая из брюшной полости у больных при перитонеальном диализе по поводу хронической почечной недостаточности. Такая жидкость содержит много макрофагов и обычно свободна от других клеток.

Само собой разумеется, что использование этого источника макрофагов ограничено, так как он доступен лишь лабораториям, расположенным вблизи клинических центров, где проводится терапия диализом. Правда, это ограничение постепенно отпадает, поскольку таких центров становится все больше — в настоящее время они созданы в большинстве учебных клиник и при многих крупных больницах. Стало быть, вполне возможно, что применение указанного источника макрофагов будет расширяться, и потому вовсе не лишними будут здесь некоторые предостерегающие замечания относительно опасностей, связанных с его применением. В случаях хронической почечной недостаточности иммунные механизмы подавлены, и полагают, что такие больные часто бывают постоянными носителями возбудителя  гепатита B, даже в отсутствие явных клинических симптомов этой болезни. Этот возбудитель находится в крови и загрязняет аппаратуру, используемую для диализа, а так как он отличается высокой инфекционностью и обычно термостабилен, то опасен не только для других больных, но и для всех, кто работает с кровью и с перитонеальным диализатом и кто обслуживает аппаратуру. Так как гепатит B, нередко протекает очень тяжело и иногда приводит к летальному исходу в остром периоде или переходит в хроническую форму, вызывая тяжелое поражение печени, при работе с перитонеальным диализатом следует соблюдать сугубую осторожность (соответствующие меры описаны ниже).

Много свободных макрофагов присутствует в легких (альвеолярные макрофаги). Мирвик и др. [28] предложили сравнительно простой метод их получения путем смывов из альвеол и (воздухоносных путей кролика. Мы не применяли этот метод сами, но у нас создалось впечатление, что, хотя он не лишен ряда недостатков, на которые мы укажем позже, этот метод позволяет получить вполне пригодный материал с высоким выходом макрофагов; посторонних клеток в нем мало, и, кроме того, они представлены главным образом нейтрофильными полиморфноядерными лейкоцитами, от которых легко избавиться.

Получение макрофагов из трех упомянутых выше источников, а именно из брюшной полости мыши и человека и из легких кролика, а также методика культивирования этих клеток подробно описаны в соответствующих разделах.

Аппаратура и материалы
Общие замечания

Все, с чем непосредственно или косвенно соприкасаются клетки или среда, должно отвечать строгим требованиям чистоты и стерильности, обязательным при работе с культурой ткани.
Стеклянную посуду моют детергентами, а затем тщательно несколько раз промывают бидистиллированной (в стеклянном дистилляторе) или деионизованной водой. Подложки из белка и других веществ, на которых выращивают клетки, удаляют со стенок сосудов ершиком. Выполнять это следует очень тщательно, так как клетки имеют тенденцию мигрировать вдоль полосок субстрата, оставляемых ершиком, в результате чего создается ошибочное представление о каком-то особом типе распределения клеток (рис. 5.1). Не следует использовать для мытья посуды такие вещества, как, скажем, хромовую кислоту, поскольку ее трудно удалить полностью. Желательно, чтобы вся стеклянная посуда, которую приходится часто мыть, была изготовлена из боросиликатного стекла, которое не подвергается коррозии под влиянием фосфатов, присутствующих во многих детергентах.
Неравномерное распределение клеток по стенке сосуда может быть также следствием царапин на стекле (рис. 5.2) или зазубрин на пластике, поэтому поверхность, на которой будут расти клетки, следует тщательно осмотреть. Для пробок и прокладок лучше всего использовать силиконовую резину. Пригодна также нетоксичная белая резина, которая дешевле силиконовой, однако она быстрее разрушается при стерилизации нагреванием.
Стеклянную посуду предпочтительнее стерилизовать не в автоклавах, а в сушильных шкафах (сухим жаром)  при 180 °С в течение полутора часов. Дело в том, что вода в автоклавах нередко содержит примеси, которые осаждаются на стенках стерилизуемых сосудов; это опять-таки создает субстрат, ведущий к артефакту распределения.
Силиконовая резина выдерживает повторную стерилизацию сухим жаром и при этом сохраняется значительно дольше, чем белая. Последнюю лучше стерилизовать другим способом, а именно автоклавированием (10 мин). При таких условиях она дольше сохраняется.
Различные камеры, сделанные из пластика, стерилизуют гамма-излучением непосредственно в процессе изготовления; это камеры одноразового пользования. Другие камеры стерилизуют погружением на 30 мин в 70%-ный спирт, приготовленный путем разведения абсолютного спирта бидистиллированной или деионизованной водой; затем четырежды споласкивают водой такой же очистки, высушивают на воздухе в стерильных камерах и облучают 30 мин ультрафиолетом, пользуясь бактерицидной лампой.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам:

Яндекс.Метрика