Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Люминесцентная микроскопия: Метод флуорохромирования — Микроскопическая техника в биологии и медицине

Люминесцентная микроскопия: метод флуорохромирования
Витальный метод.

Реактивы.
Широко применяемый флуорохром — акридин оранжевый (АО). В концентрациях для вторичной люминесценции обладает минимальной токсичностью. АО избирательно реагирует с нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК) клетки. АО с ДНК соединен по типу внедрения (молекула АО внедрена в пространство между двойными спиралями молекулы ДНК). Основной водно-солевой раствор АО готовят растворением 100 мг акридина оранжевого в 100 мл дистиллированной или бидистиллированной воды. Раствор хранят в пузырьке из темного стекла с корковой или притертой стеклянной пробкой, в темноте. Срок хранения до 1 года. Рабочий раствор АО готовят 10—100-кратным разбавлением основного раствора физиологическим раствором или раствором Рингера-Локка. Рабочий раствор хранят в холодильнике, используют в течение 3—5 дней.

Раствор Рингера — Локка:

  • 9 г хлорида натрия,
  • 0,42 г хлорида калия,
  • 0,24 г хлорида кальция,
  • 0,1 г бикарбоната натрия,
  • 1 г глюкозы, доливают до 1000 мл дистиллированной водой.

Кроме раствора АО, используют следующие смеси:

  1. Рабочие водно-солевые растворы: 0,2 мл акридина оранжевого (1:10 000),  0,4 мл конго красного (1:10 000), 2 капли фуксина кислого (1:10 000), 2 мл раствора Рингера — Локка (или физиологического).
  2. Рабочие водно-солевые растворы: 0,2 мл акридина оранжевого (1 : 10 000), 2 капли фуксина основного (1 : 10 000), 2 мл раствора Рингера — Локка (или физиологического).

Первую и вторую смеси готовят перед употреблением. Роль флуорохромов в смесях различна: конго красный тушит люминесценцию нормальных ядер и отчетливо выявляет ядра поврежденных клеток. Фуксин основной отчетливо выявляет цитоплазматическую зернистость.

Приготовление препаратов.
Способ 1: раствор флуорохрома или смесь флуорохромов разливают в пенициллиновые флаконы по 0,4 мл. Затем в эти пробирки прибавляют исследуемую кровь, взятую из пальца, или какой-нибудь другой субстрат в количестве 1-5 капилляров от гемометра Сали.

Необходимые условия стандартизации при приготовлении препаратов:
1) контакт флуорохрома (или смеси) с исследуемым материалом не должен превышать 50 мин;
2) смесь флуорохрома с материалом должна находиться в темном месте;
3) температура помещения должна быть 15—20°.
После контакта флуорохрома (или смеси флуорохромов) с исследуемым материалом каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным. Излишек жидкости, выступающий за края, отсасывают фильтровальной бумагой. Во избежание высыхания препарат сохраняют во влажной камере, края стекла иногда парафинируют.

Смешивать кровь и флуорохром в смесителе не рекомендуется, так как это не обеспечивает хорошего смешивания. Кроме того, смесители труднее мыть и сушить, пенициллиновые флаконы.

Способ 2: каплю исследуемого материала на предметном стекле смешивают с каплей рабочего раствора (1:10 000, 1:50 000 и др.) акридина оранжевого и накрывают покровным стеклом.

Способ 3: на часовом стекле смешивают несколько частей цитратной (гепаринизированной) крови с 1 частью рабочего раствора (1:10 000, 1:50 000) флуорохрома. Каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным.

Суправитальный метод.
Посуда. Предварительно заготовляют большое количество чистых предметных стекол с нанесенным на них тонким слоем спиртового раствора флуорохромов или их смесей. Используют различные флуорохромы.

Реактивы.

  1. Спиртовые растворы акридина оранжевого в разведении 1:2500, 1:10 000, 1:25 000.
  2. Спиртовые растворы примулина в разведении 1:2500, 1:10 000, 1:25 000.
  3. Спиртовые растворы трипафлавина в разведении 1:2500, 1:10 000, 1:25 000.
  4. Смесь спиртовых растворов: 0,1 мл акридина оран­жевого (1:2500), 0,2 мл конго красного (1:1000), 3 капли кислого фуксина (1:1000).

Стекла с флуорохромом могут долго сохраняться в темноте.

Приготовление препарата.
На стекле с флуорохромом (или их смесью) наносят каплю крови, костного мозга или другого исследуемого материала. Делают мазок (как мазок крови), который сразу же помещают во влажную камеру на 5—30 мин. Препарат можно исследовать сразу после приготовления и спустя длительное время. Хранить препараты следует в сухом темном месте.

Фиксированные флуорохромированные препараты.

Способ 1: мазки крови (или других субстратов) фиксируют метиловым спиртом, высушивают на воздухе, заливают на 3—5 мин рабочим водно-солевым раствором акридина оранжевого (разведение от 1:1000 до 1:50 000).

Способ 2: метод Берталанффи.
Мазки крови или других субстратов фиксируют в смеси Ники­форова 10-30 мин. Зафиксированы могут быть как свежие мазки, так и мазки, приготовленные несколько месяцев назад.
Промывают в спиртовых растворах 80%, 70% и 50% по 10—12 с в каждом.
Промывают в дистиллированной воде 1—2 с.
Промывают в 1 % уксусной кислоте в течение 1 мин.
Ополаскивают в дистиллированной воде 1—2 с.
Окрашивают 0,01% раствором акридина оранжевого на фосфатном буфере pH 6,0 в течение 3 мин.
Промывают в фосфатном буфере pH 6,0   1 мин.
Погружают в 0,1 М раствор хлорида кальция на 40 с -2 мин (для дифференцировки ядерных структур от цитоплазматических; ядро при такой окраске становится зеленым).
Ополаскивают в фосфатном буфере (pH 6,0) 1—3 с.
Заключают препарат под покровное стекло, края которого парафинируют.

Препарат может сохраняться во влажной камере несколько часов без парафинирования. Флуорохромированный мазок может быть обесцвечен в 50% эти­ловом спирте в течение 5 мин и окрашен любым способом для морфологического исследования.

Из применяемых растворов все, кроме фосфатного буферного, могут быть использованы многократно. Сохраняются в холодильнике до 1—2 мес. Буфер­ный фосфатный раствор pH 6,0 можно использовать в течение 5—7 дней.

Флуорохромирование препаратов по способу Берталанффи позволяет проводить как морфологическое, так и цитохимическое исследование форменных элементов крови и других клеток. Ядра клеток, содержащие ДНК, окрашиваются в зеленый цвет. Цитоплазма клеток, содержащих РНК, окрашивается в оранжево-красный цвет. Специфичность цитохимической окраски акридином оранжевым на ДНК и РНК по способу Берталанффи подтверждается действием на нуклеиновые кислоты специфических ферментов — дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы. Под влиянием ферментов ДНК и РНК расщепляются, зеленое и красное свечение ядер и цитоплазмы клеток исчезает. Флуорохромирование фик­сированных препаратов по первому способу придает одинаковый оранжевый цвет ядру и цитоплазме клеток (в которых есть РНК) и поэтому не позволяет устанавливать распределение ДНК и РНК в клетке.

Выявление липидов в клетках крови и других тканей (метод Берга).

Реактивы.

  1. Чистый кофеин (1,5—2. мг) растворяют в 100 мл дистиллированной воды в течение 2 сут до полного насыщения раствора. Нерастворившийся кофеин удаляют фильтрованием.
  2. 3,4-бензпирен растворяют в ацетоне (несколько мил­лиграммов в 10 мл ацетона). Раствор фильтруют.
  3. Растворы кофеина и 3,4-бензпирена смешивают в пропорции 1:10. К смеси добавляют равное количество ди­стиллированной воды, раствор фильтруют.

Ход исследования.

1.Мазок крови (или другого субстрата) флуорохромируют в смеси 3,4-бензпирена и кофеина в течение 1 мин.
2.Окрашивают в рабочем водно-солевом растворе акридина оранжевого в раз­ведении 1:10 000 в течение 1 мин.
3.Мазок накрывают покровным стеклом и хранят во влажной камере. Мик­роскопию следует производить не позже чем через 30 мин после приготовления препарата.

Липиды имеют вид ярко-голубых или голубовато-серых капель и точек на фоне розовато-серого или серо-красного цвета цитоплазмы лейкоцитов. Ядра при этом имеют различные зеленые тона.

Несмотря на то что жиры могут выявляться различными флуорохромами (нильский голубой, аурофосфин, хлорофилл), лучшие результаты в смысле наи­более полного выявления жировых веществ получаются при применении 3,4-бензпирена.

Максимум световой абсорбции и диапазон люминесценции некоторых флуорохромов

 

Люминесцентная микроскопия в гематологии клетки крови и костного мозга здоровых лиц
Ультрафиолетовая (УФ) флуоресценция (первичная).

Характерная особенность УФ флуоресценции большинства клеток — интенсивное свечение цитоплазмы при относительно слабом свечении ядра. Среди форменных элементов крови и костного мозга наиболее интенсивно флуоресцируют клетки миелоидного ряда. Незрелые формы светятся более интенсивно. По мере дифференцировки клеток флуоресценция их снижается. Элементы красного ростка на ранних стадиях развития флуоресцируют очень слабо, зрелые эритроциты не светятся. Лимфоциты лимфатических узлов флуоресцируют довольно ярко, периферической крови — очень слабо. Изменения в характере УФ флуоресценции клеток крови наступают при переходе из одного функционального состояния в другое.

Вторичная флуоресценция.
Витально флуорохромированные акридином оранжевым (АО) препараты.

Морфологические особенности форменных элементов периферической крови и костного мозга, характер свечения ядер и цитоплазматической субстанции клеток витально флуорохромированных АО препаратов отражены в табл. 1.

Ядра большинства лейкоцитов через 30—50 мин с момента взятия крови светятся ярко-зеленым цветом различных оттенков (94—99% ядер лейкоцитов), ядра 1—6% лейкоцитов (в основном зрелых гранулоцитов)—желтым или зеле­новато-желтым цветом. Кроме того, обнаруживается 2—4% лейкоцитов с нару­шенной морфологией ядра и цитоплазмы. Во всех форменных элементах крови и костного мозга АО выявляет цитоплазматическую зернистость, не идентичную зернистости в аналогичных клетках при окраске по Паппенгейму — Крюкову.

Способность живой цитоплазмы клеток концентрировать краситель на каких-либо структурах в виде гранул — защитная реакция. В цитоплазме мертвых лейкоцитов при витальном флуорохромировании оранжево-красных гранул нет.

Форменные элементы крови и костного мозга здоровых людей в витально флуорохромированных препаратах АО

Суправитально флуорохромированные препараты. Данные о вторичной люминесценции форменных элементов крови и костного мозга при окраске различными флуорохромами приведены в табл. 2.

Большинство сегментоядерных нейтрофилов здоровых людей содержит значительное и умеренное количество зернистости, 8—12% клеток имеют незначи­тельную зернистость. Метод суправитального окрашивания в отличие от ви­тального позволяет дифференцировать гранулоциты по видам специфической зер­нистости и классифицировать клетки так же, как и при окраске паноптическим методом Паппенгейма — Крюкова.

Суправитальное флуорохромирование трипафлавином и примулином выявляет, кроме того, лейкоциты патологически измененные, имеющие желтовато-розовую флуоресценцию ядер, тусклую, неравномерно расположенную зернистость цитоплазмы, выходящую за пределы клетки, и т. д. Количество их не превышает 2—5%. Таким образом, эти флуорохромы, как и АО, хорошо выявляют функциональную неполноценность лейкоцитов.

Фиксированные препараты, флуорохромированные АО. Данные о вторичной люминесценции форменных элементов крови и костного мозга, обработанных этим методом и методом Берталанффи, представлены в табл. 3.

Количество РНК в условных единицах на одну клетку рассчитывают по формуле Кеплоу:

ax+by+cz/100

где а — 3, b — 2, с— 1 —условные баллы интенсивной окраски, а именно:
а — зна­чительное содержание РНК (+++);
b—умеренное содержание РНК (++);
с — незначительное содержание РНК (+);
х, у, z — количество клеток с соответствующей интенсивностью окраски;
100 — общее количество подсчитанных клеток.

Так, незрелая клетка костного мозга здоровых людей содержит РНК в количестве 2,2 единицы, миелоцит костного мозга-1,0, проэритробласт -2,9, базофильный эритробласт -2,8, полихроматофильный эритробласт-1,4, оксифильный эритробласт-0, лимфоцит крови-1,5, моноцит крови-1,0, нейтрофил -0 единиц.

Этот визуальный метод дает возможность получать сравнительные данные (содержание РНК и других цитохимических веществ), несмотря на то, что име­ется известная неточность в системе оценки интенсивности окраски.

В основе количественного определения нуклеиновых кислот в клетке лежит явление ультрафиолетовой микроабсорбции.

В настоящее время используется методика цитоспектрофотометрии в лучах видимого спектра. Для выявления нуклеиновых кислот пользуются цитохимическими реакциями. Определяют количество комплексного соединения краситель+нуклеиновая кислота. Существует линейная зависимость между количеством исследуемой нуклеиновой кислоты и окрашенного комплекса краситель+нуклеиновая кислота. Расчет соответствующего количества нуклеиновой кислоты производят после определения количества исследуемого комплекса.

Подсчет количества форменных элементов крови и костного мозга.

Посуда и оборудование.

  1. Смесители для лейкоцитов.
  2. Видалевские пробирки или пенициллиновый флакон.
  3. Счетная камера.
  4. Покровные и предметные стекла.

Подсчет количества лейкоцитов по полям зрения.

Оборудование и посуда.

  1. Камера счетная.
  2. Видалевские пробирки или пенициллиновый флакон.
  3. Пипетки градуированные.
  4. Капилляр от гемометра Сали.

Реактивы.
Раствор акридина оранжевого 1:10 000.

Ход определения. 0,4 мг раствора акридина оранжевого 1:10 000 (1:20 000) наливают в видалевскую пробирку или пенициллиновый флакон. Кровь исследуемого набирают до метки в капилляр от гемометра Сали, вносят в ту же пробирку, размешивают и заполняют счетную камеру. Подсчет лейкоцитов производят с окуляром 15Х и объективом 8Х. Заранее для данного увеличения вычисляют площадь поля зрения. Если диаметр поля зрения 0,8 мм, то площадь поля зрения (Пr2) равна 3,14X0,4 = 0,5 мм2. Количество лейкоцитов рассчитывают аналогично обычному расчету их в камере, заменив в формуле расчета площадь большого квадрата на площадь поля зрения.

Практически количество подсчитанных лейкоцитов умножают на соответствующий коэффициент. Точность увеличивается при подсчете большего количества полей зрения.

Подсчет клеток пунктата костного мозга производят аналогично.

Подсчет ретикулоцитов.
Витально флуорохромированные АО препараты.
Реактив. 3,8% раствор цитрата натрия.
Способ 1: кровь из пальца смешивают в пробирке с изотоническим (3,8%) раствором цитрата натрия в соотношении 4:1. В пробирку добавляют равное количество рабочего раствора АО в разведении 1:10 000. После тщательного смешивания капельку смеси наносят на предметное стекло, накрывают по­кровным.
Способ 2: каплю крови из пальца смешивают на предметном стекле с капелькой рабочего раствора АО 1:10 000, накрывают покровным стеклом.
Способ 3: кровь из пальца набирают в смеситель для лейкоцитов до метки I, затем до метки II добавляют рабочий раствор АО в разведении 1:5000. Содер­жимое смесителя перемешивают в течение 2 мин. После этого каплю смеси нано­сят на предметное стекло, накрывают покровным.
При всех 3 способах приготовления препаратов жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.
В приготовленных препаратах различают:
1) оксифильные ретикулоциты — ретикулоциты, имеющие темную, сливающуюся с фоном, строму;
2) полихроматофильные ретикулоциты — ретикулоциты с тускло-зеленым свечением стромы;
3) полихроматофилы — эритроциты, имеющие тускло-зеленое свечение.

Суправитально флуорохромированные АО препараты.
Способ приготовления см. выше.

Сетчато-нитчатое вещество флуоресцирует ярким красно-оранжевым свечением. Эритроциты имеют темно-зеленые очертания, легко поддаются счету по полям зрения. Полихроматофильные ретикулоциты и полихроматофилы при этом способе не выявляются. Тромбоциты имеют желто-оранжевое свечение и могут быть подсчитаны одновременно с ретикулоцитами.

Подсчет ретикулоцитов в фиксированных флуорохромированных АО мазках крови не производят, так как сетчато-нитчатое вещество выявляется нечетко. Полихроматофилы имеют оранжево-коричневое свечение.

Подсчет ретикулоцитов в люминесцентном микроскопе по сравнению с обычным более точен: обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества.
При суправитальном флуорохромировании яркость и четкость выявления структуры сетчато-нитчатого вещества дает возможность дифференцировать ретикулоциты по степени зрелости: форма клубка, полносетчатые, неполносетчатые и остаточные (классификация Гейльмейера).

При витальном флуорохромировании АО крови выявляют 2 разновидности ретикулоцитов: оксифильные и полихроматофильные, а также полихроматофилы. Другие методы окраски ретикулоцитов позволяют обнаружить только оксифильные ретикулоциты.

Клиническое значение.

У здоровых лиц ретикулоциты представлены только оксифильными формами. При увеличении абсолютного числа ретикулоци­тов преобладание полихроматофилов и полихроматофильных ретикулоцитов свидетельствует о резком усилении интенсивности регенерации красной крови, что наблюдается при постгеморрагических, гемолитический и других формах мало­кровия. Уменьшенное количество ретикулоцитов с преобладанием полихромато­филов и полихроматофильных ретикулоцитов сигнализирует об истощении резервов эритропоэза.

Базофильная зернистость эритроцитов при витальном флуорохромировании АО, как и при флуорохромировании фиксированных препаратов, выявляется в виде включений желтовато-зеленых тонов.

Различают 4 вида эритроцитов с базофильной пунктацией:

1) эритроциты;
2) полихроматофилы;
3) оксифиль­ные ретикулоциты;
4) полихроматофильные ретикулоциты.

При незначительной степени хронического свинцового отравления наибольшее количество элементов с базофильной пунктацией составляют базофильно-пунктированные эритроциты. Остальные виды элементов с базофильной зернистостью содержатся в неболь­шом количестве, при тяжелых формах свинцового отравления число последних возрастает.

При витальном флуорохромировании АО тельца Жолли представляют собой шаровидные ярко-зеленые включения, кольца Кебота — тонкие кольцевидные об­разования зеленого цвета. Для лучшей видимости этих образований целесооб­разно пользоваться дополнительным подсвечиванием от обычного источника освещения. При этом выявляется строма эритроцитов.
При суправитальном флуорохромировании АО и флуорохромировании АО фиксированных препаратов кольца Кебота и тельца Жолли светятся красным. При флуорохромировании по способу Берталанффи эти образования имеют зе­леное свечение.

Люминесцентная микроскопия в диагностике некоторых заболеваний

Исследование феномена клеток красной волчанки (LE-клеток).

Метод ви­тального флуорохромирования АО крови (см. выше). LE-клетки имеют большую величину, чем нормальные лейкоциты. Гомогенное включение флуоресцирует зеленым цветом, оттесняет ядро к периферии. Интенсивность свечения включений LE-клеток различна. Иногда оно более интенсивно, иногда такое же, как свечение ядер сегментоядерных лейкоцитов.

Суправитальное флуорохромирование АО препаратов.

Цитратную кровь больных красной волчанкой выдерживают при комнатной тем­пературе в течение 2 ч. Каплю крови наносят на покровное стекло, которое накладывают на предметное стекло с предварительно нанесенным на него тон­ким слоем спиртового раствора АО в разведении 1:2500. Тела LE-клетки имеют гомогенную структуру, флуоресцируют светло-зеленым цветом. Ядра лейкоцитов светятся более темно-зеленым цветом, некоторые ядра лейкоцитов бесцветны.

Флуорохромирование фиксированных препаратов кро­ви (метод Уигнол, Каллинг и Вессар, 1961).

Реактивы.
1.  Реактив Шиффа. 1 г., двухлористого акрифлавина смешивают с 2 г метабисульфита калия, рас­творяют в 200 мл дистиллированной воды и прибавляют 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты.
2.  Метиловый спирт.
3. 1 н. раствор соляной кислоты.
4. 1 % раствор кислого алкоголя (1 часть абсолютного спирта и 1 часть ледяной уксус­ной кислоты).
5. Абсолютный этиловый спирт.
6. Ксилол.
7. Синтетическая резина.

Ход определения.
1. Мазок фиксируют в метиловом спирте 2 мин.
2.Помещают в 1 н. раствор соляной кислоты при температуре 60° на 3 мин.
3.Промывают водой.
Погружают в реактив Шиффа на 20 мин.
Промывают в 2 порциях 1% кислого этанола (в первой 5 мин, во второй 10 мин).
Про­мывают в абсолютном этаноле несколько раз.
Просветляют ксилолом.
За­ключают в синтетическую резину.

LE-включение флуоресцирует светло-желтым цветом на темном фоне, ДНК ядер — ярко-желтым цветом.

Выявление трихомонад (по А. Б. Деражне, 1961)
Реактивы.

  1. Основной раствор АО 1:1000.
  2. Рабочий раствор АО — разведение 1:40 000 на фосфатном буфере pH 7,0.

Ход определения.
На край чистого предметного стекла наносят иссле­дуемый материал, делают тонкий мазок, высушивают. Хранить препарат можно в сухом темном месте длительное время. Перед исследованием на мазок наносят  несколько капель рабочего раствора АО. На препарат накладывают покровное стекло, избыток краски отсасывают фильтровальной бумагой, микроскопируют.

Трихомонады меньше клеток плоского эпителия и больше лейкоцитов. Ядро вытянутое, овальной формы, светится зеленым или желто-оранжевым цветом. Цитоплазма кирпично-красная, иногда желто-коричневая. Люминесцентная мик­роскопия трихомонад позволяет обнаружить их чаще, чем при обычных методах цитологического исследования.

Выявление возбудителя туберкулеза.

Метод окраски Аурамином ОО и родамином С
Оборудование и реактивы для окраски флюорохромными красителями
Для окраски препаратов флюорохромными красителями необходимы:
— раковина или специальный вместительный лоток для проведения окраски;
— специальный штатив («рельсы») для окраски мазков на предметных стеклах;
— пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками:
— газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;
— металлический стержень для приготовления ватного тампона, используемого вместо горелки для фиксации препарата перед окраской, если он не фиксирован ранее в сушильном шкафу;
— раствор флюоресцентных красителей;
— раствор для обесцвечивания мазков;
— раствор для гашения фона обесцвеченного мазка;
— емкость с дистиллированной водой для промывания мазков;
— штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.

При окраске флюорохромными красителями ни в коем случае нельзя подогревать мазки и пользоваться фильтровальной бумагой.

Промывание мазков в процессе окраски следует производить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.

Микроскопию производят по возможности сразу же после окончания процедуры окраски люминесцентными красителями и высыхания мазков. В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции.

При окраске мазков необходимо:
— избегать неполного обесцвечивания, т.к. кислотоустойчивые микобактерии практически не обесцвечиваются;
— не делать толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле.

Мазки, которые использовались для флюоресцентной микроскопии, в случае сомнений в истинности феномена кислотоустойчивости можно повторно окрасить по методу Ziehl-Neelsen.

Метод окраски аурамином ОО и родамином С
Реактивы:
— спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
— кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
— метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
— аурамин ОО (аурамин О-Sigma);
— родамин С, ТУ-6-09-2463-77 (родамин В-Sigma);
— вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов:
Раствор 1. Раствор аурамина — родамина:
Аурамин ОО -1,0 г
Родамин С- 0,1 г
Вода дистиллированная- 1000 мл.

Каждый краситель растворяют отдельно в 150 — 200 мл дистиллированной воды и помещают в термостат при 37 °C на 18 — 24 часа. Затем растворы сливают в одну емкость и доводят общий объем до 1000 мл. Приготовленный раствор красителей хранят в емкости из темного стекла в прохладном, защищенном от света месте.

Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует допускать попадания на кожу его порошка или раствора.

Раствор 2. Обесцвечивающий раствор:
Концентрированная соляная кислота 3 мл
Этиловый спирт 96° 97 мл.

Аккуратно добавить 3 мл концентрированной соляной кислоты к 97 мл этилового спирта.
Предупреждение: осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот.

Раствор 3. Гаситель фона:
Метиленовый синий хлорид  25 мг
Вода дистиллированная  100 мл.
В 100 мл дистиллированной воды растворить 25 мг метиленового синего хлорида.

Хранение растворов.
Написать на этикетке название раствора, концентрацию, дату приготовления и срок хранения. Растворы желательно хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 3 месяцев. Перед использованием растворов их просматривают для исключения преципитата. Если последний обнаружен, раствор можно профильтровать.

Процедура окраски:
— стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы «рельсы» для окраски так, чтобы они не касались друг друга;
— мазки заливают раствором 1 на 1 час.

Предупреждение: нельзя нагревать мазки и использовать полоски фильтровальной бумаги;
— тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой;
— обесцвечивают раствором 2 (солянокислый спирт) в течение 3 минут;
— промывают дистиллированной водой;
— гашение фона осуществляют раствором 3 в течение 1 минуты. Если препарат имеет интенсивную синюю окраску, можно очень аккуратно повторно промыть его дистиллированной водой;
— мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

2. Метод окраски аурамином О
Реактивы:
— спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
— кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
— фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;
— аурамин О-Sigma (2465-27-2);
— акридиновый оранжевый, С.I.46005 или перманганат калия, ГОСТ 10163-76;
— вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;
— безводный двузамещенный фосфат натрия, ГОСТ 4172-66.

Приготовление растворов:
Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О:
Аурамин 0,1 г.
Этиловый спирт 96° 10 мл. Растворить аурамин в спирте.

Раствор 2. Раствор фенола:
Фенол кристаллический 3,0 г
Дистиллированная вода 87 мл.
Расплавить кристаллы фенола (температура плавления 41 °C) и растворить его в дистиллированной воде, пользуясь подогреванием на водяной бане. Довести общий объем до 90 мл.

Раствор аурамина О.
Смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла, которую необходимо хранить в прохладном затемненном месте. В процессе хранения раствор может стать мутным, однако это не влияет на качество окрашивания.

Раствор 3. Обесцвечивающий раствор:
Концентрированная соляная кислота 0,5 мл
Технический 70° этиловый спирт 100 мл.
Аккуратно добавить концентрированную соляную кислоту к 70° этиловому спирту.

Растворы 4. Гасители фона:
Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать растворы перманганата калия или акридинового оранжевого.

а) Раствор перманганата калия:
Перманганат калия (KMnO4) 0,5 г
Дистиллированная вода 100 мл.
Растворить пермганганат калия в дистиллированной воде и перелить в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. На этикетке обозначить название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

б) Раствор акридинового оранжевого:
Безводный двузамещенный фосфат натрия (Na2HPO4) 0,01 г
Дистиллированная вода 100 мл
Акридиновый оранжевый 0,01 г.
Растворить фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавить акридиновый оранжевый.

Хранение реактивов.
Хранят приготовленные растворы в плотно закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название раствора, дату приготовления и срок годности. Готовый раствор может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение 3 месяцев.

Процедура окраски:
— стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы «рельсы» для окраски так, чтобы они не касались друг друга;
— мазки заливают раствором аурамина О на 15 минут;
— тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой;
— обесцвечивают раствором 3 (0,5% раствор солянокислого спирта) в течение 2 минут;
— промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор, пока не смоются все остатки краски;
— гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или акридинового оранжевого в течение 2 минут. При использовании перманганата калия время его воздействия не должно превышать 2 минут. Точность экспозиции имеет решающее значение, так как при передержке интенсивность флюоресценции микобактерий может уменьшаться;
— мазки промывают дистиллированной водой;
— мазки высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

Нельзя нагревать мазки и использовать полоски фильтровальной бумаги.

3. Хранение приготовленных мазков
Приготовленные мазки хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре. Используют специальные коробки. Стекла не должны соприкасаться друг с другом для исключения повреждения целостности мазка. Положительные мазки хранят 1 год и более, если больной находится это время в стационаре. Окрашенные флюоресцентными красителями мазки чувствительны к ультрафиолетовому свету, особенно во время процесса бактериоскопии, и способны за несколько секунд обесцветиться. Для исключения этого мазки просматривают достаточно быстро, а при необходимости сделать паузу перекрывают поток света от лампы шторкой. Обесцветившиеся мазки можно повторно окрасить, однако это не всегда приводит к полному восстановлению препарата.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: