Малярия
Основной метод паразитологического диагноза малярии — исследование окрашенной толстой капли. По сравнению с тонким мазком толстая капля является методом обогащения, так как за один и тот же промежуток времени исследуется в 20—40 раз больше крови, вследствие чего повышаются шансы обнаружения паразитов. Чувствительность метода толстой капли такова, что при обычном просмотре препарата в течение 5 минут (что примерно соответствует 100 полям зрения) можно обнаружить паразитов при наличии их в крови в количестве около 10 экземпляров в 1 мм3. Но при окраске нефиксированной толстой капли, в которой эритроциты разрушаются, форма паразитов почти всегда изменяется, вследствие чего микроскопист должен обладать значительным опытом и должен прежде всего научиться распознавать виды малярийных паразитов в тонких мазках.


Исследование тонкого мазка необходимо применять, когда распознавание вида возбудителя в толстой капле бывает затруднительным. Идентификация Plasmodium ovale, как правило, должна производится по тонкому мазку. Поэтому во всех подозрительных на малярию случаях необходимо брать каплю и мазок(1)

(1) Для обнаружения малярийных паразитов в экстренных случаях можно ш следовать свежую кровь. В капле крови между предметным и покровным стеклом паразиты в эритроцитах распознаются в виде просветлений, обнаруживающий амебовидное движение при применении согревательного столика. Во взрослых стадиях можно различить зерна пигмента. Хорошо распознаются в свежей капле крови гамонты возбудителя тропической малярии. Хотя этот метод чрезвычайно прост, в практической работе он применяется лишь в исключительных случаях.

Ниже приведены способы приготовления толстой капли.
1. Предметным стеклом касаются выступившей капли крови. Не отнимая стекла от капли, круговыми движениями доводят диаметр капли до 1—1,5 см.
2. Предметным стеклом касаются выступившей капли крови. Углом другого предметного стекла размазывают каплю до нужного диаметра и толщины.
3. Walker (I960) предложил делать четырехугольную толстую каплю, размазывая кровь, как при повторном методе, углом предметного стекла. Shute, Маryon считают, что в такой капле форменные элементы и паразиты распределяются более равномерно, чем в обычных толстых каплях, в которых середина толще краев.
4. На предметном стекле готовят мазок несколько толще обычного. Затем на мазок, пока он влажный (!), наносят каплю крови. Кровь на влажном мазке хорошо растекается правильным диском. При этом, чем больше взятая капля, тем больше площадь, по которой она распределяется. Поэтому высота капли остается примерно одинаковой независимо от объема взятой крови. Паразиты и форменные элементы распределяются по площади толстой капли, приготовленной этим способом, более равномерно, чем в каплях, приготовленных обычным способом. Часть мазка, свободная от капли, служит местом, где простым (!) карандашом можно сделать необходимые записи. При последующей обработке эта надпись хорошо сохраняется.
Мазок за пределами толстой капли вследствие неполного гемолиза эритроцитов может быть использован для уточнения диагноза.
5. Метод Рухадзе в модификации Штанько: каплю готовят на мазке по четвертому способу; в течение 5-10 секунд препарат оставляют в горизонтальном положении до подсыхания прилежащей к капле зоны мазка, после чего стекло быстрым движением переводят в почти вертикальное положение, в котором его оставляют на 1-2 секунды. За это время кровь стекает к нижнему полюсу капли. Затем препарат высушивают в наклонном положении под углом 60°. При исследовании образующегося полулунного осадка вероятность обнаружения паразитов по сравнению с обычной толстой каплей (четвертый способ) повышается в среднем в 4 раза.
6. Способ двуслойной капли по Штанько: каплю готовят на мазке по четвертому способу; после того как подсохнут ее края, на нее наносят еще одну каплю крови. Подсохшие края первой капли ограничивают ее растекание на определенной площади, вследствие чего высота толстой капли увеличивается и соответственно увеличивается объем исследуемой крови. Вероятность обнаружения паразитов по сравнению с обычной толстой каплей повышается в среднем в 2 раза.
В некоторых случаях на одном предметном стекле готовят отдельно на небольшом расстоянии тонкий мазок и толстую каплю.

Ш. Д. Мошковский предложил следующую методику приготовления такого комбинированного препарата. На предметное стекло наносят мазок разной толщины так, чтобы толстый непосредственно переходил в тонкий, что достигается изменением нажима и угла наклона шлифовального стекла. На толстый участок мазка, пока он влажен, наносят каплю крови. После ее высыхания на границе толстого и тонкого участков мазка проводят линию куском парафина или восковым карандашом. Тонкий мазок фиксируют спиртом, а затем весь препарат окрашивают обычным способом.
Толстые капли перед окраской не фиксируют.
Высушивание толстых капель должно происходить постепенно (не на солнце и без подогревания). Только что приготовленные толстые капли нередко при окраске или промывании препарата отстают от стекла. Поэтому, если обстоятельства позволяют, окраску лучше проводить через несколько часов после взятия крови.
Толстые капли окрашивают в течение 20-25 минут 4—5% водным раствором краски Романовского (азур-эозин по Романовскому). Для лучшей окраски малярийных паразитов необходимо, чтобы реакция воды была нейтральной или слабощелочной (pH 7,0—7,2). Pampana предложил разводить краску Романовского на нейтральном буферном физиологическом растворе. При этом поле зрения оказывается очень чистым, без нитей фибрина, что облегчает распознавание малярийных паразитов. Этот способ особенно хорош для окрашивания капель, взятых несколько дней назад.
В жарком климате при длительном хранении неокрашенных толстых капель может произойти их фиксация.
Для предотвращения фиксации Waker предложил обработку толстых капель до их окраски за буференным раствором метиленового синего, который готовят следующим образом: метиленового синего 0,2 г, Na2HPO4-0,6 г, КН2Р04-0,2 г, смесь порошков хорошо растереть и добавить дистиллированной воды 300 мл.
Толстую каплю после высыхания погружают в этот раствор на 1 секунду, промывают и высушивают. В таком виде капля может храниться длительное время. Перед исследованием ее окрашивают по Романовскому в течение 6—10 минут.

При окраске по Романовскому цитоплазма паразитов воспринимает голубой цвет разной интенсивности, ядро окрашивается в вишнёво-красный цвет. Интенсивность окраски зависит от качества краски и реакции воды, на которой приготовлен раствор.

Последовательные возрастные формы бесполых эритроцитарных паразитов обозначается следующим образом.
1. Мерозоит — самая ранняя стадия, форма круглая или овальная, размеры от 1 до 2,5 мк. Около ядра небольшой комочек цитоплазмы.
2. Кольцевидный шизоит (кольцо) — узкий ободок цитоплазмы окружает небольшую вакуоль; имеет одно ядро.
3. Амебовидный шизонт — имеет разную форму в зависимости от количества и величины псевдоподий, с возрастом увеличивается в размере. Имеет одно ядро.
4. Делящийся шизонт -содержит два ядра и больше.
5. Морула — полное разделение ядра и цитоплазмы на мерозоиты.
Половые формы — гамонты — не имеют вакуолей и псевдоподий, мужские (микрогамонты) и женские (макрогамонты) различаются между собой по величине и структуре ядра, по интенсивности окраски/ цитоплазмы, а также по размерам.

Четыре вида возбудителей малярии человека — Plasmodium vivax — возбудитель трехдневной малярии, Plasdium malariae-четырехдневной,  Plasmodium falciparum-тропической,  Plasmodium ovale-близкой к трехдневной («ovale — малярии»)-распознают по форме и размерам бесполых и половых форм (шизонтов и гамонтов), размерам мерозоитов и их числу в моруле, цвету пигмента и распределению его в цитоплазме, характеру пораженных эритроцитов (форма, размер, цвет, наличие зернистости).

Морфология возбудителей малярии в тонких мазках.
Кольца Р. vivax, Р. malariae и Р. ovale сходны между собой. Они имеют размер от 2 до 4 мк и занимают приблизительно 1/3 диаметра эритроцита. У колец Р. vivax Р. malariae ядро круглое. Ядра колец Р. ovale более крупные, часто имеют неправильную форму. Ободок цитоплазмы не широкий, суживающийся к ядру. Контуры цитоплазмы ровные. Располагаются кольца обычно в средней части эритроцита.
Молодые кольца Р. falciparum мелкие, размером от 1,25 до 1,5 мк. Они занимают примерно 1/6 часть диаметра эритроцита. Ядро маленькое, круглое. На нем замыкается очень тонкий нижний ободок цитоплазмы. У некоторых колец обнаруживается раздвоение ядра: рядом с ядром в окрашенном препарате располагается круглое образование, симулирующее его, но несколько меньшее по размеру. Это образование соответствует плотной центральной части ядра, выделившейся из него при механическом воздействии в процессе приготовления мазка.
В некоторых случаях могут обнаруживаться более взрослые крупные кольца, размер которых соответствует примерно 7з диаметра эритроцита. Ободок цитоплазмы таких колец толстый, резко суживающийся к ядру. В толстом участке цитоплазмы могут быть различимы единичные мелкие зерна пигмента. Иногда кольца лежат распластавшись в форму узкого серпа вдоль ребра эритроцита.
При тропической малярии, как правило, в периферической крови из форм бесполого цикла обнаруживают только кольца. Численность их может быть велика уже в первые дни болезни. При этом в одном эритроците может обнаружиться 2-3 кольца и более.
Амебовидные шизонты Р. vivax имеют разнообразную, иногда причудливую форму благодаря наличию одной или нескольких псевдоподий. Всегда имеется вакуоль, иногда их бывает несколько. Ядро круглое или овальное. Пигмент разбросан в цитоплазме в виде темно-коричневых зерен неодинаковой величины и формы. В зависимости от возраста паразит занимает большую или меньшую часть эритроцита.
Амебовидные шизонты Р. malariae округлые или овальные. Псевдоподии короткие и широкие. Цитоплазма окрашивается в более темный цвет, чем Р. vivax. Пигмент более грубый. Ядро неправильной формы, часто угловатое. Некоторые шизонты Р. malariae принимают форму ленты, расположенной поперек эритроцита. Ширина ленты определяется возрастом паразита. Ядро лентовидных форм продолговатое, вытянутое вдоль края ленты.

Амебовидные шизонты Р. falciparum круглой или овальной формы, часто имеют равные контуры. Вакуоли, как правило, не бывает. Ядро круглое или неправильной формы. Пигмент черного цвета собран в одну компактную кучку. В отличие от возбудителей трех других форм малярии эти и последующие формы бесполого цикла развития Р. falciparum, как правило, в периферической крови не встречаются. Эритроциты, содержащие эти формы паразита, задерживаются в капиллярах внутренних органов и глубоких тканей. Скопления эритроцитов с паразитами в капиллярах головного мозга могут привести к развитию комы и летальному исходу.
Для предупреждения таких осложнений при подозрении на малярию необходимо срочное исследование крови, в особенности у лиц, возвратившихся из тропических стран.
Молодые шизонты Р. ovale часто сохраняют форму кольца. Более взрослые имеют большое сходство с шизонтами Р. malariae.
Делящиеся шизонты разных видов возбудителей малярии различаются главным образом по размерам. Наиболее крупные —Р. vivax, несколько мельче — Р. ovale, еще мельче — Р. malariae, самые мелкие— Р. falcipatum.
Морула Р. vivax состоит из 10—22 мерозоитов (чаще 14—16), которые расположены в эритроцитах, как правило, беспорядочно. Среди мерозоитов лежит кучка пигмента.
В моруле Р. malariae 6—12 (чаще 8) крупных мерозоитов, расположенных вокруг кучки пигмента в виде розетки.
Морула Р. falcipafum состоит из 8—24 очень мелких мерозоитов, занимает не весь эритроцит.
Число мерозоитов в моруле Р. ovale колеблется от 4 до 14 (чаще 8). Мерозоиты крупные, ядро часто неправильной формы.
Гамонты Р. vivax, Р. malariae и Р. ovale круглой или овальной формы, наиболее крупные — у Р. vivax, самые мелкие — у Р. malariae. Зерна пигмента в гамонтах более крупные, чем в шизонтах, и более равномерно распределены в цитоплазме. У женских гамонтов ядро небольшое, компактное, расположено ближе к краю цитоплазмы. Цитоплазма окрашена в темно-голубой цвет. Ядро мужских гамон тов крупное, рыхлое, окрашено в розовато-фиолетовый цвет, расположено обычно в центре. Цитоплазма светло-голубая.
Гамонты указанных трех видов малярийного паразита появляются- и исчезают из периферической крови одновременно с шизонтами.
Гамонты Р. falciparum имеют полулунную форму. Ядро занимает среднюю часть цитоплазмы, у женских форм оно небольшое и компактное, у мужских — крупное и рыхлое. Пигмент в виде коротких палочек окружает ядро. В тонких мазках гамонты обнаруживают лежащими свободно между клетками крови (не в эритроцитах). В перекрашенных препаратах обычно заметен тонкий контур оболоч ки эритроцита, особенно на вогнутой стороне гамонта.
Срок развития гамонтов Р. falciparum в эритроците в отличие от других видов малярийных паразитов в несколько раз превышает длительность шизогонии. Гамонты появляются в периферической крови, как правило, после достижения максимального размера, что наступает через 8—40 дней после первого обнаружения колец. В дальнейшем гамонты продолжают поступать в кровь и могут обнаруживаться в ней в течение нескольких недель после исчезновения колец и прекращения клинических явлений.
Эритроциты, пораженные Р. vivax, обесцвечиваются и увеличиваются в диаметре в среднем до 10-12 мк. Степень обесцвеченности и увеличения пораженного эритроцита прямо пропорциональна размерам паразита. Таким же изменениям подвергаются эритроциты, пораженные Р. ovale, но в меньшей степени. Размеры и цвет эритроцитов, содержащих Р. malariae и Р. falciparum, остаются без изменения. Небольшая часть эритроцитов, содержащих Р. vivax, приобретает неправильную форму. Приблизительно третья часть эритроцитов, пораженных Р. ovale, принимает овальную форму, у некоторой части эритроцитов одна из узких сторон неровная, зубчатая (бахромчатая) Изменение формы эритроцитов, пораженных Р. ovale, особенно отчетливо выражено в тонком участке мазка.
При окраске по Романовскому (pH 7,0—7,4) в эритроцитах, содержащих разные стадии Р. vivax, выявляется обильная и мелкая азурофильная зернистость (зернистость Шюффнера). При Р. ovale об наруживается также зернистость, но более редкая и крупная (зерни стость Джеймса).
У части эритроцитов с крупными кольцами Р. falciparum при продолжительной окраске (более часа) мазков иногда выявляется не большое число крупных азурофильных зерен (пятнистость Маурера)
В эритроцитах, пораженных Р. malariae, при очень длительном окрашивании мазков щелочным раствором краски (в течение 2 часов при pH 7,6—7,8) выявляется (непостоянно) очень мелкая зернистость (зернистость Циммана), не имеющая диагностического значения.

Морфология возбудителей малярии в толстых каплях. Кольца К. vivax, Р. malariae и Р. ovale, имеющие приблизительно одинаковые размеры, в толстой капле практически почти не различаются между собой. Большинство колец в толстой капле разрывается, деформируется, часто имеет форму запятой, восклицательного знака. Иногда около ядра цитоплазма сжимается в виде круглого или треугольного комочка. При этих трех формах малярии одновременно с кольцами практически во всех случаях обнаруживаются и другие стадии паразитов, по которым возможно определение вида.

Кольца Р. falciparum претерпевают те же изменения. Часть колец сохраняет свою форму и хорошо различима, несмотря на малые размеры. Иногда цитоплазма располагается с двух сторон ядра (крылья ласточки). При большой численности паразитов, как правило, обнаруживаются кольца с раздвоенным ядром. В некоторых случаях в препарате могут обнаруживаться лишь единичные крупные кольца (большей частью у бессимптомных носителей). В этих случаях дифференциальный диагноз бывает затруднителен. Однако отсутствие других стадий исключает остальные виды паразита.
Амебовидные шизонты Р. vivax в толстой капле деформируются. Цитоплазма сжимается и разрывается, и тогда около ядра обнаруживаются два или несколько комочков цитоплазмы неодинакового размера. Такие «разорванные» шизонты являются характерными для Р. vivax. В некоторых случаях молодые амебовидные шизонты имеют вид сильно растянутых неправильной формы колец с крупной вакуолью.
Форма шизонтов Р. malariae в отличие от шизонтов Р. vivax в толстой капле очень однообразна. Это компактные овальные или округлые образования, реже неправильной формы, обычно имеют обильный пигмент. Их размеры определяются возрастом, но они мельче, чем шизонты Р. vivax.
Стадии меруляции разных видов распознаются по числу мерозоитов и по форме морулы, часто сохраняющей у Р. malariae характерную форму розетки и в толстой капле.
Во многих случаях распознавание Р. vivax облегчается наличием не полностью гемолизированных пораженных эритроцитов. В таких эритроцитах может сохраняться зернистость Шюффнера.
Шизонты и морулы Р. ovale чрезвычайно сходны с соответствующими стадиями Р. malariae и отличаются от них лишь более крупными ядрами и менее обильным пигментом. Как и для Р. vivax, характерно наличие сохранившихся пораженных эритроцитов. Отличить Р. ovale в толстой капле от Р. vivax можно с достаточной достоверностью по следующим признакам: крупные, неправильной формы ядра паразитов, отсутствие крупных разорванных амебовидных шизонтов, крупные мерозоиты и меньшее их число в моруле. Общим с Р. vivax является наличие сохранившихся пораженных эритроцитов, особенно отчетливо выявляемых по периферии толстой капли. Последний признак является наиболее характерным для отличия Р. ovale от Р. malariae в толстой капле.
Женские гамонты Р. vivax и Р. malariae в толстой капле практически неотличимы от взрослых шизонтов. Мужские гамонты (более крупные для Р. vivax) можно отличить по крупному ядру, окруженному узким ободком бледно-голубой цитоплазмы с разбросанными по ней зернами пигмента.
Гамонты Р. falciparum легко определяются по характерной полулунной форме. При медленном высыхании толстой капли в наиболее толстых участках могут обнаруживаться округлившиеся гамонты Р. falciparum, формой и размерами чрезвычайно напоминающие одноядерные шизонты Р. malariae. В таких случаях на периферии капель и в тонких местах обнаруживаются гамонты Р. falciparum, сохраняющие полулунную форму.
Правильно приготовленная и окрашенная толстая капля должна иметь светлый фон с отчетливо окрашенными тромбоцитами и сетками — остатками ретикулоцитов, без нитей фибрина и осадка краски. При нормальной толщине капли (толстая капля на мазке) в каждом поле зрения с иммерсионной системой должно быть 15-20 лейкоцитов. Помимо просмотра наиболее толстых участков капли, необходимо исследовать ее периферию, где чаще сохраняются пораженные эритроциты, что может облегчить дифференциальный диагноз. При подозревании на малярию продолжительность просмотра капли должна быть не менее 10-15 минут. В некоторых случаях рекомендуется исследовать несколько капель.
Длительный тщательный просмотр толстой капли необходим не только в случаях, когда число паразитов в крови очень мало, но и во всех случаях, когда в толстой капле имеется много паразитов и они обнаруживаются уже в первых полях зрения. Тщательный просмотр капли может позволить обнаружить присутствие единичных форм малярийных паразитов другого вида, например гамонтов Р. falciparum при большом количестве Р. vivax.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам:

Яндекс.Метрика