Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Метод морфологической диагностики микроглиоза в белом веществе головного мозга: инструкция — Микроскопическая техника в биологии и медицине

Метод морфологической диагностики микроглиоза в белом веществе головного мозга: инструкция
В настоящей инструкции по применению (далее — инструкция) предложен метод морфологической диагностики и оценки микроглиоза в белом веществе головного мозга при различных заболеваниях на основе иммуногистохимического выявления биохимического маркера микроглии.
Настоящая инструкция предназначена для врачей-патологоанатомов, врачей-нейро- и онкоморфологов.
Перечень используемых сокращений
ИГХ — иммуногистохимия
CD68 — рецептор к клеткам микроглии
ДАБ — диаминобензидин

Перечень необходимого оборудования, реактивов, средств, изделий медицинской техники
Оборудование

  1. Микротом с возможностью изготовления гистологических срезов толщиной не более 4 мкм.
  2. рН-метр.
  3. Термостат.
  4. Автоматические пипетки переменного объема.
  5. Баня водяная с датчиком температуры.
  6. Световой микроскоп.
  7. Таймер/секундомер.

Реактивы и расходные материалы

  1. Предметные стекла для ИГХ (или предметные стекла предварительно обработанные поли-L-лизином или силаном).
  2. Покровные стекла.
  3. Лабораторная посуда (колбы, пробирки, стеклянные палочки, воронки, стаканы, контейнеры для предметных стекол).
  4. Ксилол.
  5. 96% спирт.
  6. Перекись водорода 3%.
  7. Tris-HCI — отмывочный буфер, рН = 7,5.
  8. Буфер для разведения специфических антител.
  9. Буфер для демаскировки антигенов, рН = 6,0.
  10. Карандаш для ИГХ.
  11. Раствор ДАБ.
  12. Первичные моноклональные антитела к CD68 (клон КР1). Обязательным условием является наличие в спецификации указания о возможности использования на формалин-фиксированных тканях человека.

Показания к применению
Заболевания и патологические состояния, сопровождающиеся микроглиозом в белом веществе головного мозга.

Противопоказания для применения
Отсутствуют.

Описание технологии использования метода
Забор материала для исследования
Головной мозг извлекается из черепа, помещается в раствор 10% нейтрального формалина и фиксируется в течение 7 дней. Для исследования берут по 1 фрагменту из симметричных участков правой и левой лобной, теменной, височной и затылочной долей головного мозга, а также 2 фрагмента симметрично из гиппокампа (рис.).

Рис. — Схематичное отображение участков забора материала для исследования
Белое вещество полушарий головного мозга исследуется в пределах от границы VI слоя коры до условной линии, соединяющей основание извилины с фундальными отделами расположенных рядом борозд.
Вырезку гиппокампа следует проводить таким образом, чтобы в препарате определялись основные структурные поля гиппокампа (СА1-СA3). Морфометрическую оценку состояния клеток микроглии в гиппокампе следует проводить в слое Alveus, а также в молекулярном слое аммонова рога и зубчатой фасции.
Технология использования иммуногистохимического метода определения экспрессии CD68

I этап — депарафинирование и обезвоживание

  1. Поместить стекла с парафиновыми срезами последовательно в две порции ксилола на 10 мин.
  2. Стекла поместить последовательно в три порции этанола 96% на 3 мин.
  3. Промыть срезы в трех порциях дистиллированной воды и поместить последовательно в две порции дистиллированной воды на 5 мин в каждую.

II этап — предобработка с целью демаскировки антигенов, направленная на восстановление структуры белка, которая изменилась в ходе фиксации и заливки в парафин

  1. Поместить срезы в емкость с демаскировочным буфером рН = 6,0 и погрузить на 10 мин в водяную баню при температуре 96-99°С.
  2. После демаскировки оставить емкость со срезами при комнатной температуре на 20 мин.
  3. Промыть срезы в двух порциях дистиллированной воды по 5 мин.
  4. Поместить срезы в 3% раствор перекиси водорода на 20 мин.
  5. Промыть в дистиллированной воде 3 раза по 2 мин.

III этап — проведение иммуногистохимической реакции

  1. 1.Срезы обвести карандашом для ИГХ.
  2. Нанести первичное антитело (анти-CD68), разведенное согласно указаниям производителя в буфере для разведения специфических антител. Слайды разместить горизонтально в герметичной емкости, дно которой покрыть фильтровальной бумагой, смоченной водой. Емкость поместить в холодильник на ночь.
  3. Слить со срезов жидкость.
  4. Срезы промыть в Tris-буфере 2 раза по 5 мин.
  5. Нанести на срезы визуализирующую систему на полимерной основе к мышиным или кроличьим антителам, или универсальную (к мышиным и кроличьим антителам) на 30 мин.
  6. Промыть в Tris-буфере 2 раза по 5 мин.
  7. Нанести раствор ДАБ, приготовленный в соответствии с рекомендациями изготовителя непосредственно перед нанесением на срезы, инкубировать 6-8 мин. Длительность инкубации в ДАБ устанавливается в каждой лаборатории индивидуально, для чего необходимо наблюдать процесс появления коричневого окрашивания под микроскопом. Время окрашивания считается достаточным, если структуры, подлежащие окрашиванию, приобрели ярко-золотисто-коричневый цвет, в то время как фоновое окрашивание стромальных компонентов отсутствует.
  8. Слить со срезов жидкость и промыть дистиллированной водой.
  9. Срезы докрасить гематоксилином Майера. Время окрашивания зависит от качества и степени зрелости гематоксилина и составляет 40-60 с.
  10. Промыть дистиллированной водой.

IV этап — просветление и заключение срезов

  1. Обезвоживание в спиртах.
  2. Просветление в ксилоле.
  3. Заключение в канадский бальзам.

Для контроля активности первичных антител в каждой серии необходимо проведение одного отрицательного и одного положительного контрольного окрашивания. В качестве отрицательного контрольного окрашивания срезы вместо инкубации с первичным антителом покрываются 1% раствором сывороточного альбумина. В качестве положительного контроля для антител к CD68 могут быть использованы случаи церебральной патологии с известной высокой экспрессией данных маркеров в ткани головного мозга. Окраска расценивается как положительная только при отсутствии окрашивания в отрицательном контрольном препарате и как отрицательная — при наличии окрашивания в положительном контрольном препарате.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам: