Прямой метод часового культивирования клеток костного мозга для хромосомного анализа по Фитцжеральду и соавт.

Принцип метода.
Деление клеток костного мозга» находящихся на равных стадиях митотического цикла, останавливают колхицином на стадии метафазы, наиболее удобной для хромосомного анализа.

Оборудование и реактивы.

1. Питательная среда Игла (среда № 199) или Раствор Хенхса.
2. Фитогемагглютинин (ФГА),
3. Колхицин (порошкообразный).
4. Гипотонический раствор -0,075М раствор хлорида калия или 0,44% раствор трехзамещенного цитрата натрия.
5. Ацетат спирта 3 объема абсолютного спирта этилового или метилового, 1 объем ледяной уксусной кислоты.
6. Цельная сыворотка крупного рогатого скота.
7. Гепарин (патентованный раствор).
8. Краски азур и эозин.
9. Настольный бокс с бактерицидной лампой (ящик из стекла или плексигласа с отверстиями для рук, закрытыми резиновыми перчатками).
10. Холодильник.
11.Термостат на +37С
12. Центрифуга на 1000 оборотов.
13. Шприцы на 10,0 и 1,0 мл; иглы к ним.
14. Микропипетки.
15. Пастеровские пипетки.
16. Пипетки, градуированные на 1,0—10,0 и 20,0 мл.
17. Пробирки стерильные 10Х70 мм с резиновыми пробками (от пенициллиновых флаконов), закрепленными лейкопластырем.
18. Центрифужные пробирки.
19. Флаконы пенициллиновые с собственными пробками.
20. Резиновые баллоны для пипеток или тонкая резиновая трубка со стеклянным наконечником (для выдувания жидкости ртом).
21. Пробки резиновые (размер 10-12).
22. Предметные стекла.
23. Лейкопластырь.
24.Центрифуга на 800 об/мин с широкими стаканчиками на 150 мл.

Ход определения.
1. 0,3-1 мл костномозгового пунктата вводят в центрифужный стакан, содержащий 10 мл раствора Хенкса, 2 капли гепарина и 0,1 мл 0,04% раствора колхицина и оставляют на 30 мин — 1 ч в термостате при 37С
2. В центрифужный стакан, содержащий культуру, вводят 100 мл 0,555% раствора хлорида калия и оставляют на 508 мин. Если добавляют 0,44% раствор трехзамещенного цитрата натрия, то оставляют на 20 мин при 37С.
3. Центрифугируют стакан с культурой 30 мин при 800 об/мин.
4 Надосадочную жидкость удаляют.
5. На осадок по стенке накапывают 2 капли ацетата спирта и оставляют на 30 мин.
6. Наслаивают, не встряхивая стакана, 2-3 мл ацетата спирта и оставляю на 15 мин.
7. Центрифугируют 8 мин при 1000 об/мин.
8. Надосадочный слой удаляют, на осадок наслаивают осторожно 2-3 мл ацетата спирта и оставляют на 15 мин.
9.Центрифугируют 8 мин при 1000 об/мин, удаляют часть надосадочного слоя
10 Приготовление препарата  (см. методику Аракаки)

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Сообщить об опечатке

Текст, который будет отправлен нашим редакторам:

Яндекс.Метрика